生物质燃烧有机示踪物的液相色谱-质谱分析方法研究

徐宏辉 徐婧莎 何 俊* 浦静姣 杜荣光 齐 冰

1(浙江省气象科学研究所，杭州 310008)2(宁波诺丁汉大学， 化学环境工程系， 宁波315100) 3(杭州市气象局， 杭州 310051)

1 引 言

生物质燃烧是大气气溶胶和温室气体的重要来源[1～4]。生物质燃烧排放污染物成分复杂，如何利用分子示踪物更深入地研究生物质燃烧对区域及局部地区大气污染的影响具有重要的现实意义[5～8]。水溶性钾、左旋葡聚糖类化学物质在气溶胶粒子源解析研究中通常被用于表征生物质燃烧。粒子中水溶性钾产生于生物质燃烧、海盐和土壤扬尘等过程，理论上讲，使用水溶性钾来估算生物质燃烧会使结果偏高，因此近年来的研究多使用左旋葡聚糖类作为生物质燃烧的示踪物质[9～11]。

大气气溶胶中生物质燃烧有机示踪物可被溶剂萃取，经衍生化处理后由气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测法进行分析[12,13]，但是衍生化处理过程复杂，分析时间长，而且处理过程中不可避免地会造成待分析成分的损失，从而影响分析结果的准确性。近年来，无需衍生化直接对左旋葡聚糖及异构体进行检测的分析法已有报道，如离子排斥色谱法[14]、高效液相色谱-脉冲安培检测[15]、高效液相-气溶胶电荷检测[16]、高效液相-质谱法以及离子色谱-脉冲安培检测等[17,18]。其中，采用离子色谱-脉冲安培检测方法，左旋葡聚糖检出限为60 μg/L(200 ng/m3)[18]；采用高效液相色谱-脉冲安培检测方法，3种单糖类的检出限在20～50 μg/L之间[15]；采用高效液相色谱-串联四极杆质谱联用检测方法，以NaOH溶液为流动相，该流动相经过离子源时会在高温下析出晶体，堵塞离子源接口，从而可能对质谱造成不可逆转的影响，该方法对3种目标物的检出限为30 μg/L[19]。这些方法对于检测受气溶胶污染较少的地区或气溶胶浓度较低天气的气溶胶样品具有一定局限性。

本研究利用高效液相色谱及三重四极杆线性离子阱质谱(HPLC-ESI-MS/MS)，通过优化相关分析参数，建立了对上述3种目标有机示踪物无需衍生化处理过程即可进行直接同时检测的快速分析方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

HPLC-30A高效液相色谱仪(日本岛津公司)； ABsciex 3200 Q trap三重四极杆线性离子阱质谱仪(HPLC-ESI-MS/MS，加拿大AB SCIEX公司)。

左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖、甘露醇标准品(美国Sigma-Aldrich公司)。实验用水为超纯水。称取左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖各10.0 mg，用适量水溶解并定容至100 mL，得100 mg/L的单标溶液，分别用水稀释得5 mg/L单标溶液。另取100 mg/L单标溶液各1 mL混合，加水稀释并定容至100 mL，得1 mg/L的混标溶液，用于方法优化。

2.2 液相色谱和质谱条件

色谱柱选用Dionex Carbopac MA1阴离子交换分析柱(250 mm×4 mm)及Carbopac MA1保护柱(50 mm×4 mm)，质谱离子源采用电喷雾离子源。

流动相为0.001%(w/V)氨水-水(10∶90，V/V)，流速设定为0.35 mL/min，柱温箱温度为45℃。最佳离子喷雾电压设定为——3800 V，雾化气气压设定为0.26 MPa，雾化温度设定为650℃，辅助加热气气压设定为0.55 MPa，气帘气气压设定为0.32 MPa。进样量为10 μL。每两个样品之间采用相同的液相条件平衡柱子3 min。

2.3 实际样品采集和测定

在2014年11月12日～2015年11月12日，于长三角地区4个采样点利用大流量(1.05 m3/min)和中流量采样仪(80 L/min)采集大气中PM2.5样品；采样点包括：宁波诺丁汉大学、宁波气象局、临安区域本底站和杭州气象局。采样频率为每6天1次，1次采样24 h，空白样品每月收集1次。大流量采样使用玻璃滤膜(18.2 cm×23.2 cm，武汉天虹公司)；中流量采样使用石英滤膜(直径90 mm，Whatman公司)。采样前滤膜在550℃下烘烤5 h，去除有机物残留，采样前后在恒温恒湿的条件下平衡24 h后称重，采样后滤膜于——18℃保存，直至对样品进行提取分析。

采样获得的大流量气溶胶样品，剪取3 cm×3 cm的滤膜；获得的中流量气溶胶样品，剪取1/8的滤膜，分别加入3 mL水，在室温下超声萃取45 min，然后过0.45 μm滤膜，用HPLC-ESI-MS/MS进行测试。

3 结果与讨论

3.1 特征离子的选择

3种目标示踪物和内标化合物偏中性，且含多个羟基，因此选择负离子模式，手动调整质谱各分析参数，如碰撞能量(CE) 等，使各离子强度最高，每个离子的质荷比(m/z)精确到0.1 amu。左旋葡聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖互为同分异构体，拥有相同的母离子，即m/z160.9(表1)。左旋葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖及甘露醇-1-13C的子离子见表1。

表1 目标示踪物及内标化合物的特征母离子及子离子质荷比

Table 1 Parent ion (m/z) and product ion (m/z) of target compounds and internal standard

化合物Compound特征母离子Parent ion (m/z)特征子离子Product ion(m/z)生物质燃烧示踪物Biomass burning tracers左旋葡聚糖 Levoglucosan160.9101.0/113.0/129.0甘露聚糖 Mannosan160.9101.0/129.0半乳聚糖 Galactosan160.9101.0/113.0同位素内标化合物Internal standard甘露醇-1-13C Mannitol-1-13C182.059.0/71.0/89.1/101.0

3.2 高效液相色谱参数的优化

左旋葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖均为极性碳水化合物，但极性有差别，本研究对高效液相色谱分析条件及参数进行优化。选用适合单糖类分离的阴离子交换分析柱(CarboPac MA1, 250 mm×4 mm, 戴安公司)及保护住(CarboPac MA1, 50 mm×4 mm)对目标化合物进行分离。该类色谱柱仅适用碱性溶液作为流动相，考虑到NaOH溶液在高温下会析出晶体，堵塞离子源接口，本研究采用氨水溶液(HPLC级，美国Sigma-Aldrich公司)作为流动相。实验证明，流动相梯度浓度的改变对目标物的分离和灵敏度影响不大，因此液相参数的优化主要是对流动相浓度、流速以及柱温箱温度进行优化。

氨水作为流动相，通过改变流动相浓度可以改变流动相的pH值，从而改变柱子对样品的保留，影响样品的分离和保留时间。实验结果表明，3种有机示踪物的分离受流动相氨水浓度变化的影响不大，其原因可能是氨水为弱碱，在0.00001%～0.001%(w/V，约0.005～0.5 mmol/L)范围内，pH值变化不大(约为9～10)。但是3种有机示踪物的峰值受流动相氨水浓度变化的影响显著。如图1所示，左旋葡聚糖的峰值受流动相浓度变化的影响最显著，但由于它的峰值明显高于其它两种目标物的峰值，且在空气颗粒物中的浓度也明显高于其它化合物，因此对流动相浓度的优化主要考虑其它两种有机示踪物。甘露聚糖和半乳聚糖在氨水流动相浓度为0.0005%(w/V)时的峰值最高。因此，选定流动相氨水的浓度为0.0005%(w/V，约0.264 mmol/L)。

采用不同的流速可得到不同的柱效，由于柱子的适用流速范围为0.2～0.5 mL/min，在实际实验操作中，当流速≥0.45 mL/min时，柱压接近或超过最大值14 MPa，因此，考察流速为0.20、 0.25、 0.30、0.35和0.40 mL/min时的柱效。 如图2所示，流动相流速为0.35 mL/min时，3种目标物峰值最高。因此，选择流动相流速为0.35 mL/min。

图1 流动相中氨水浓度的变化对目标示踪物甘露聚糖、半乳聚糖和左旋葡聚糖峰值信号的影响Fig.1 Optimization of concentration of ammonia in mobile phase for analysis of mannosan, galactosan and levoglucosan

图2 流动相流速对3种目标示踪物峰值的影响Fig.2 Effect of flow rate on peak intensities of mannosan, galactosan and levoglucosan

MA1分析柱耐受温度为4℃～50℃，为确保柱子的柱效，长时间使用柱子时，柱温以不超过其最高温度的90%为宜。柱温越高，样品保留时间越短，峰形越窄，峰的响应值越高。考察柱温为25、30、35、40 及 45℃时的分离情况。如图3所示，当柱温低于35℃时，甘露聚糖和半乳聚糖未得到良好分离，且这两种物质拥有相同的母子离子对，不能用提取不同母子离子对的方式分别进行定量分析。左旋葡聚糖在柱温为40℃时峰值最高，而其它两种目标物在柱温为45℃时峰值最高，由于这两种化合物在空气中的浓度明显低于左旋葡聚糖，因此，为了能使所有待测物都能在较低浓度的情况下得到检测，柱温选择45℃。

图3 柱温箱温度变化对3种目标示踪物峰值的影响Fig.3 Effect of column temperature on peak intensities of mannosan, galactosan and levoglucosan

3.3 质谱参数的优化

采用质谱多反应监测(MRM)模式，结合优化后的液相色谱参数确定初步的LC-MRM方法。设定只有m/z160.9和m/z182.0的母离子(表1)能通过一级质谱(MS1/Q1)进入碰撞室(q2)，设定在碰撞室被打碎的碎片子离子中m/z101.0、m/z113.0和m/z129.0等特征子离子(见表1)能通过二级质谱(MS2/Q3)并被最后的检测器检测；相同的母-子离子对的化合物参数相同。最后选择丰度最高的母-子离子组合进行定量分析，其它母-子离子组合用于定性分析。

质谱参数优化过程采用上述初步确定的LC-MRM方法，设定不同的离子源和化合物参数后，自动进样分析。分析结束后，根据最高峰值的各参数选择LC-MRM方法的质谱参数。每个离子对的化合物参数都经多次优化后取最佳值，使其灵敏度最高，最终优化得到的质谱参数见表2。

表2 优化后的化合物质谱参数

Table 2 Optimized mass spectrometric parameters

3.4 特征离子色谱图

图4 3种有机示踪物和内标物甘露醇-1-13C的液质联用特征母子离子色谱图Fig.4 HPLC-MS/MS chromatogram of 3 kinds of organic tracers and internal standard mannitol-1-13C

采用上述建立的高效液相色谱-质谱方法对3种目标示踪物和内标物甘露醇-1-13C的标准样品进行检测，它们的特征离子色谱图见图4。3种目标化合物得到了良好的分离，甘露聚糖和甘露醇-1-13C有部分重叠，但由于这两种物质拥有不同的母-子离子对，因此，各离子对可分别从图中提取，进行定量分析。

3.5 方法分析性能

目标有机示踪物的检出限、校准曲线浓度范围、线性系数及回收率、重复率见表3。 方法检出限(LOD)定义为信噪比≥ 3时的化合物浓度。萃取液中的检出限浓度同时换算为在空气中的24 h日均浓度。如表3所示，萃取液中检出限介于1.8 μg/L(左旋葡聚糖)和9.5 μg/L(半乳聚糖)之间，换算为大流量采样器采集的空气中的日均浓度为0.2～1.2 ng/m3，中流量采样器采集的空气中的日均浓度为0.4～2.0 ng/m3,都低于相关参考文献中的检出限[14～18]，说明与其它的检测方法相比，本方法对于较低浓度(ng/m3级)的示踪物有很好的检测效果。

表3 高效液相色谱串联三重四极杆线性阱质谱的分析方法评估结果

Table 5 Evaluation results of HPLC-ESI-MS/MS method

分析物Analyst检出限 Limits of detection (LOD)萃取浓度Extractconcentration(μg/L)气溶胶浓度aAerosolconcentration(ng/m3)气溶胶浓度bAerosolconcentration(ng/m3)标准曲线浓度范围Concentrationrange(mg/L)重复率(标准样品峰面积,n=5)Reproducibility(Standards, RSDof peak area, n=5)重复率(气溶胶样品峰面积,n=4)Reproducibility(Aerosol samples,RSD of peak area, n=4)加标回收率Recovery ofspikedstandards(%)左旋葡聚糖Levoglucosan1.80.20.40.01～12.00.6108.4±1.6甘露聚糖Mannosan5.80.71.20.01～11.97.7104.7±1.8半乳聚糖Galactosan9.51.22.00.01～11.65.1106.5±1.9甘露醇-1-13CMannitol-1-13C5.6n.ac.n.ac0.01～11.6n.a.101.3±1.8a 24 h PM2.5 样品, 1,512 m3 采样空气体积. 24 h PM2.5 sample, 1,512 m3 air sampling volume ; b 24 h PM2.5样品, 115.2 m3采样空气体积. 24 h PM2.5 sample, 115.2 m3 air sampling volume; c甘露醇-1-13C 作为内标物在实际空气颗粒物样品中几乎不存在,不能被检测到。Mannitol-1-13C as internal standard is not present in actual air and cann't be detected.

结合目标物的保留时间和特征离子对3种目标示踪物以及内标物甘露醇-1-13C进行定性分析，用丰度最高的离子对对3种目标物进行定量分析，定量分析采用外标曲线法，线性方程见表5，3种化合物具有良好的线性关系(R> 0.999)。为了确保方法测定结果的准确性，测试开始前和结束后都需要进行校准标线，多次进样后也需要进样一次标准样品进行检测。对标准样品以及实际气溶胶样品的重现性(重复率)测试结果见表5。标准样品的5次重复测试，3种目标化合物的峰面积相对标准偏差(RSD)都小于2.2%；对于实际气溶胶样品的4次重复测试，左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的峰面积RSD分别为0.6%、7.7%和5.1%，尽管甘露聚糖和半乳聚糖峰面积相对标准偏差相对较高，但由于它们在气溶胶中的浓度也相对较高，对实际浓度测定的影响不大，因此，本方法的重现性良好。

同时，还对加标空白样的回收率进行了测试。提前烘烤过的5张90 mm空白滤膜样品经测试不含上述目标化合物或其浓度低于检出限，然后将每张空白膜剪取相同1/8张的大小，加入100 mg/L的左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的单标溶液各30 μL，常温干燥，剪碎，加入3 mL水进行超声萃取45 min，过滤萃取液，用建立的方法检测，结果见表5，左旋葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖的回收率分别为108.4%± 1.6%、104.7%± 1.8%和106.5%± 1.9%。用本方法可直接同时检测3种示踪物，各示踪物的检出限均达到ng/m3级，且回收率高，检测准确，重现性好，方法稳定。

4 结 论

建立了高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱分析方法，对左旋葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖3种生物质燃烧有机示踪物无需衍生化处理过程即可直接同时检测，有助于提高该类气溶胶成分的检测效率，并降低了检测成本。本方法检出限低、灵敏度高、样品回收率高、重现性好，为生物质燃烧类气溶胶的日常分析提供了一种简单、可靠、高效、准确的分析方法，也为气溶胶的源解析工作提供了可靠依据。