不同方法预处理的玉米秸秆结构与酶解分析

史旭洋 钱 程 刘 艳 刘心同 尚 鑫 刘 硕刘禹廷 于藴波 张 军 任晓冬*

1(吉林大学生命科学学院， 长春130012) 2(吉林省公安厅物证鉴定中心， 长春 130000)

1 引 言

木质纤维素是自然界上最丰富的自然资源，利用木质纤维素可以生产多种生物化工产品。目前，农业废弃物秸秆、麦秆等的处理成为影响环境和生态的重大问题。通过生物炼制的手段将秸秆、麦秆等木质纤维素制成生物化工产品，是秸秆高效转化的重要途径[1]。利用木质纤维素进行生物炼制，首先需要对木质纤维素进行糖化，将木质纤维素转化为葡萄糖等单糖后，再通过发酵将葡萄糖转化成生物化工产品[2]。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素3种成分组成，其中半纤维素和木质素相互缠绕，将纤维素包裹起来形成一种相互缠绕的结构，这种复杂的空间结构使木质纤维素可以有效抵抗外部环境。在进行生物炼制时，这种特性使得纤维素酶降解纤维素的效率降低[3]。因此，在利用木质纤维素时，需要对其进行预处理，打开纤维素、半纤维素和木质素相互缠绕的结构，以提高纤维素酶的水解效率。目前，工业上使用的预处理方法主要有H2SO4、NaOH、CaO和H2O2处理等方法[4]。其中H2SO4等稀酸溶液在预处理过程中主要是破坏秸秆中的半纤维素成分，通过溶解部分半纤维素，从而打开秸秆本身纤维素、半纤维素和木质素相互缠绕的结构；NaOH、CaO和H2O2等碱性溶液主要是破坏秸秆中木质素成分，从而破坏秸秆原有的结构。

本研究采用不同方法对玉米秸秆进行预处理，分别用扫描电镜、傅里叶变换红外光谱和X-射线衍射对预处理的秸秆进行分析，探讨了不同的预处理方式对秸秆结构的影响。对不同方式预处理的秸秆进行了纤维素酶酶解效率评价，为利用玉米秸秆生产生物化工产品提供了理论依据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200 Series高效液相色谱仪(德国安捷伦公司); FEI Quanta200扫描电镜(荷兰FEI公司)；Shimadzu IRPrestige-21 傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)；Bruker D8 晶体衍射仪(XRD，德国布鲁克公司)；HZ-8802S 水浴恒温振荡器(上海智诚公司)；722E型可见分光光度计(上海光谱公司)；标准品均购于自Sigma-Aldrich公司；H2SO4、NaOH、CaO和H2O2等试剂均为优级纯；实验用水为去离子水。玉米秸秆为吉林省种植的玉米的秸秆。

2.2 秸秆的预处理

秸秆的预处理参照文献[4]的方法。向500 mL摇瓶中加入30 g玉米秸秆，分别加入60 mL 10% (m/V) H2SO4、60 mL 10% (m/V)NaOH或12 g CaO，加水至总体积为300 mL，使H2SO4、NaOH或CaO的终浓度分别为2%、2%和4%。用封口膜封口，121℃ 反应1 h；另向500 mL摇瓶中加入30 g秸秆，之后加入20 mL 30% H2O2，加水至总体积为300 mL，即H2O2的终浓度为2%，用5 mol/L NaOH调节至pH 11.5，然后在65℃水浴摇床中摇振3 h。在500 mL摇瓶中加入30 g秸秆，加水至总体积为300 mL，煮沸1 h。

待上述各反应体系温度降至室温后，用八层纱布过滤预处理液，用去离子水冲洗处理后的秸秆，室温晾干后，——20℃保存，备用。

2.3 成分分析

玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量按美国能源部可再生能源实验室(NREL)的方法测定[5]。

2.4 电镜观察

取少量预处理后的样品，分别烘干、粉碎、过筛，用导电双面胶带固定在样品台上，在真空环境下进行镀金处理，物料表面形成一层导电膜后，用扫描电子显微镜(SEM)进行观察。

2.5 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析

取预处理后的样品，以 1∶100 比例同KBr混匀后，在玛瑙研钵中研磨至200～300目粉末，于红外压片机上制成透明薄片，利用傅里叶变换红外光谱仪进行测试，波数扫描范围为4000～400 cm——1，分辨率为4 cm——1，单一样品共进行32 次累加。

2.6 X-射线衍射分析

取预处理后的样品，用Bruker D8 晶体衍射仪进行纤维素的结晶度分析。其中，扫描范围 10°～50°(2θ)，扫描速度 2°/min，扫描电压30 kV，扫描电流30 mA。样品的结晶度(CrI)采用公式(1)计算：

CrI(%) =[(I002-Iam)/I002]×100

(1)

式中，I002为 002 晶格衍射角的峰值，即结晶区的衍射强度；Iam为无定形区域衍射强度峰值。

2.7 纤维素酶酶解反应

取含1.2 g纤维素的上述预处理秸秆，加入pH 5.0的50 mmol/L柠檬酸缓冲液和15 FPU/(g 纤维素)的纤维素酶，补加水至40 mL。置于水浴摇床上，50℃以130 r/min酶解72 h，每12 h 取样一次，离心，取上清液。利用高效液相色谱仪，采用伯乐Aminex HPX-87H柱测定葡萄糖浓度。高效液相色谱条件为： 柱温65℃，用0.005 mol/L H2SO4以0.6 mL/min的流速洗脱。

3 结果与讨论

3.1 不同预处理方式对秸秆成分的影响

秸秆中纤维素、半纤维素和木质素三者之间复杂的结构关系，严重阻碍了纤维素酶对纤维素的可及性，从而降低了纤维素酶水解产率。因此,需要采用化学和物理方法对秸秆进行预处理，尽可能除去秸秆中的木质素和半纤维素，打破秸秆原有的结构，从而提升酶解效率[6]。采用不同方式预处理的秸秆成分如表1所示。经过不同方式预处理后，秸秆的纤维素含量均上升，而木质素含量均下降。H2SO4预处理后秸秆的纤维素含量最高，达59.8%，木质素含量为16.8%。NaOH预处理后，纤维素含量为52.1%， 木质素含量仅为8.3%。CaO和碱性H2O2处理后，纤维素含量分别为41.5%和49.9%，木质素含量分别为14.7%和13.0%。相比于其它预处理方法，H2SO4预处理后， 半纤维素含量下降最大(22.6%)，表明H2SO4预处理可有效去除半纤维素。热水预处理后，秸秆成分变化不明显。在所有预处理方式中，NaOH去除木质素效果最好。在利用纤维素酶水解秸秆时，木质素会吸附纤维素酶，从而降低纤维素酶对纤维素的有效降解。通过预处理去除木质素，有利于提高纤维素酶对纤维素的降解效率。

表1 采用不同方式预处理后秸秆的成分分析

Table 1 Composition of corn stover pretreated with different methods

预处理方法Pretreatmentmethod纤维素Cellulose(%)半纤维素Hemicellulose(%)木质素Lignin(%)H2SO4 59.822.616.8NaOH 52.130.28.3CaO 41.532.614.7H2O2 49.929.113.0热水 Hot water38.730.818.8未处理Untreated35.835.319.1

3.2 电镜分析

利用扫描电镜观察到预处理后秸秆表面结构和形貌的变化，如图1F所示，未处理的秸秆表面被蜡质成分紧密包裹，十分光滑。稀H2SO4处理后(图1A)，秸秆整齐、紧密的长管结构被打乱和切断，这是由于秸秆中的大部分半纤维素被稀酸水解[7]，秸秆的部分结构被破坏所致。NaOH 处理后的秸秆如图1B所示，由于NaOH溶解后，很多木质素被去除[8]，秸秆表面变得粗糙不平，而且表面结构有大片明显塌陷，部分纤维素被剥离，呈片状结构。图1C为碱性H2O2预处理后的秸秆，可以看出，由于部分木质素的去除，出现很多的“碎片”。 图1D为CaO预处理后的秸秆，相比NaOH处理和碱性H2O2处理，CaO处理对木质纤维素结构的改变不明显，因为木质素脱除效果不佳，秸秆表面结构未出现明显的坍塌情况。图1E为热水处理后的秸秆结构图，秸秆表面出现凹形小孔，而秸秆的长管结构未被切断，表面也没有出现大片的明显塌陷。

图1 不同方法预处理后秸秆的电镜图： (A) H2SO4预处理后的秸秆； (B)NaOH预处理； (C)碱性H2O2预处理后； (D)CaO预处理后的秸秆； (E)热水处理； (F)未处理的秸秆Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM) images of corn stove pretreated with (A) H2SO4; (B) NaOH; (C) H2O2; (D) CaO; (E) hot water; (F) SEM image of untreated corn stover

3.3 傅里叶变换红外光谱分析结果

利用傅里叶变换红外光谱对不同预处理的秸秆进行分析，结果如图2所示。预处理和未处理秸秆红外吸收峰的主要差异在于某些特征峰的增强、减弱或者消失，这表明采用不同预处理方法后，秸秆各成分的分子结构、空间结构或排列发生了变化。

图2 不同预处理方式秸秆的傅里叶变换红外光谱图Fig.2 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of corn stover pretreated with different methods

3.4 X-射线衍射分析结果

纤维素中存在结晶区和无定形两种区域， 结晶区占纤维素整体的百分率称为纤维素的结晶度。纤维素的结晶度是衡量纤维素性能的重要指标，反映纤维素聚集时形成结晶的程度[11]。利用XRD技术分析预处理后的秸秆，比较预处理前后秸秆结晶度变化，考察各种预处理方法的效果。经过不同的预处理后，由于秸秆中一些成分去除，秸秆结构发生改变，结晶度也发生改变。如表2所示，NaOH、碱性H2O2和CaO这3种碱性方式预处理秸秆后， 秸秆的结晶度分别为40.5%、35.4%和14.2%。其中， NaOH处理的秸秆结晶度上升幅度最大。NaOH处理秸秆后，由于半纤维素和木质素这两种无定形区组分的溶出，使得纤维素含量增加，从而使整体结晶度大大提高[12]。而碱性H2O2和CaO的碱性比NaOH低，因此预处理后秸秆结晶度提升不大。H2SO4预处理秸秆后会引起纤维素基质的部分重结晶， 因此秸秆的结晶度得到明显提升[13]。由表2可见，H2SO4预处理后秸秆的结晶度最高(43.4%)，结晶度的增加可能是由于H2SO4去除了部分木质素和较多的半纤维素成分(表1)，使秸秆纤维结构发生重排，有序度增加，形成比较完整的结晶晶格，因此结晶度提高。热水预处理后秸秆的结晶度变化不明显(25.4%)，表明热水预处理对秸秆的结构改变很小，其结晶度未发生明显改变。

表2 不同预处理后秸秆的结晶度

Table 2 Crystalline of corn stover pretreated with different methods

预处理方法Pretreatment method结晶度Crystalline (%)1H2SO4 43.42NaOH 40.53CaO 14.24H2O2 35.45热水 Hot water25.46未处理 Untreated22.3

图3 不同方法预处理后的秸秆的纤维素酶降解结果Fig.3 Enzymatic hydrolysis of pretreated corn stovers hydrolyzed with cellulase

3.5 纤维素酶酶解分析

在利用秸秆进行生物化工产品生产的过程中，需将秸秆进行酶解，这是秸秆利用的基础；为了提高秸秆的酶解效率，需要采用不同的预处理方法对秸秆进行处理，从而打开秸秆本身的结构。本研究以不同方式预处理的秸秆为底物，用纤维素酶进行酶解，评价预处理效果。酶解结果如图3所示，不同方式预处理的秸秆酶解效果差异较大。以未处理的秸秆为底物酶解，葡萄糖产量在60 h达到最高，浓度达到11.95 g/L，而预处理秸秆酶解后葡萄糖产量都比未预处理秸秆高。其中NaOH预处理秸秆所产生的葡萄糖在60 h时达到最大浓度(33.32 g/L)，明显高于其它预处理方式。NaOH预处理后秸秆表面结构有明显坍塌(图1)，能够增加酶与底物接触面积。红外光谱分析表明，NaOH预处理后，木质素得到有效消除，有利于纤维素酶吸附到纤维素上，使得NaOH预处理后秸秆的酶解产糖量达到最大。H2O2预处理的秸秆酶解60 h时，产糖量最高(24.49 g/L)。CaO处理的秸秆酶解后在60 h时，产糖量最高达15.88 g/L。电镜和红外光谱分析结果表明，碱性H2O2和CaO预处理与NaOH预处理结果相似，都是通过不同程度地溶解木质素，增加纤维素和纤维素酶的可及度，从而增加酶解产糖量。由于碱性H2O2和CaO碱性较弱，对木质素的溶解作用不强，因此酶解效果比NaOH预处理差。H2SO4预处理秸秆后，酶解产葡萄糖量在60 h时达到最大值(21.21 g/L)，与未处理秸秆相比，糖化效果明显提升。电镜分析表明，H2SO4处理后的秸秆表面出现明显塌陷，有利于纤维素酶附着。红外光谱分析表明，半纤维素和木质素等成分被去除，有利于纤维素酶作用于纤维素。热水预处理秸秆酶解后产糖量在60 h时达到最大值(13.13 g/L)，相比于未处理秸秆，产糖量略有提升。从图1可见，热水预处理秸秆结构基本未发生变化；秸秆的红外光谱分析结果同样表明，热水预处理后，木质素和半纤维素等特征峰的强度均没有明显的改变，即秸秆的结构未明显改变，糖化产糖效率较低。

4 结 论

采用不同方式预处理秸秆，利用扫描电镜、红外光谱和X-射线衍射对不同方式预处理后的秸秆微观结构进行了分析，考察了不同的预处理方式对秸秆结构的影响。通过纤维素酶酶解预处理后的秸秆，对预处理秸秆效果进行了评价。本研究通过分析比较不同的方式预处理的秸秆，评价酶解效果，为利用秸秆高效生产生物化工产品提供了依据。