Toll样受体4在小鼠小脑组织中的表达情况分析

朱健伟 李益飞 王兆涛 贾伟强 陈晨 顾应江 胡蓉 徐如祥

小脑作为掌管运动平衡、协调随意运动、维持步态姿势的重要中枢被人们所熟知，这与其结构密切相关。小脑皮层由蒲肯野细胞层（purkinje cell layers，PL）及其外侧的分子层（molecular layers，ML）和内侧的颗粒细胞层（granule cell layers，GCL）共同构成一个“三明治样”的结构，蒲肯野细胞的胞体平行排列于PL，其发出的树突分支延伸到ML，而其轴突则延伸到有颗粒细胞构成的GCL。此外，在蒲肯野细胞的胞体周围还定居着伯格曼胶质细胞，其胞体位于PL，而胶质纤维则延伸到ML[1]。

Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一种跨膜类识别受体，在先天性免疫反应中具有重要的信号转导作用，并且在中枢神经系统的炎症反应和神经免疫性疾病中都有重要的作用，而Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）在这其中发挥着主导作用[2-4]。曾有研究证实，TLR4在中枢神经系统中主要表达于小胶质细胞中，然而近年来TLR4逐渐被发现在神经前体细胞（neural progenitor cells，NPCs）和神经元中均有表达，其作用涵盖了神经性疼痛、神经退行性病变的发生发展以及神经可塑性，并且参与了成年海马区的神经发生[5-11]。然而上述研究主要集中于中枢神经系统的大脑部分，对TLR4在小脑中的作用却未曾阐述。因而，本研究主要通过免疫荧光染色的方法率先探索TLR4在小脑组织中的表达，为后期揭示TLR4在小脑功能中的作用提供理论依据。

材料与方法

一、实验动物及分组管理

选取6月龄大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窝对照的野生型（TLR4+/+）小鼠作为研究对象。TLR4-/-小鼠购自南京大学动物模式中心，经与野生型小鼠杂交后得到杂合子（TLR4+/-）小鼠。然后通过TLR4+/-小鼠交配繁殖得到实验所用的TLR4-/-小鼠及其同窝对照的TLR4+/+小鼠。所有小鼠均饲养于12 h昼夜周期的标准SPF级实验动物房内，且给予充足的水和食物。

二、实验试剂及仪器

TLR4抗体ab13556（Abcam公司，美国）；钙结合蛋白抗体300（Swant公司，瑞士）；离子钙接头蛋白（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1） 抗体ab5076（Abcam公司，美国）；性别决定区Y盒2号蛋白（sex determination region Y-box 2，Sox2）抗体 sc-17320（Santa Cruz公司，美国）；神经元特异核蛋白（neuron specific nuclear protein，NeuN）抗体ab104224（Abcam 公司，美国）。 莱卡冰冻切片机（CM1950，德国）；莱卡激光共聚焦显微镜（TCS SP5，德国）。

三、实验动物分组管理

实验所用小鼠根据DNA鉴定结果分为TLR4-/-组和TLR4+/+组，TLR4+/+组小鼠小脑组织用于抗体阳性染色，而TLR4-/-组小鼠小脑组织作为抗体阴性对照染色。

四、标本制备

6月龄大小的小鼠，经3.6%的水合氯醛麻醉后心脏灌注磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），待全身血液被置换出以后给予4%的多聚甲醛灌注。完整取出小鼠脑组织并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定，24 h后用蔗糖溶液（10%、20%、30%）进行梯度脱水。分离小脑组织，以25 μm的厚度进行冰冻切片，并收集于载玻片上。

五、免疫荧光染色

冰冻切片于空气中干燥15 min后，放入PBS溶液中摇晃清洗5 min，后放入含有0.3%辛基酚聚氧乙烯醚溶液的PBS中摇晃10 min×3次，随即用10%的胎牛血清溶液于室温下封闭1 h。弃去封闭液后加入稀释好的一抗液（TLR4、钙结合蛋白、Iba-1、Sox2、NeuN 等一抗）于 4℃下孵育 16～18 h，PBS摇晃清洗后加入稀释好的二抗溶液并于室温下孵育1 h。PBS 摇晃清洗 10 min×3 次， 用 4’，6-二脒基-2-苯基吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封 片 剂进行封片，而后于激光共聚焦下拍摄获取一抗表达的荧光图像，并分析TLR4的细胞定位及其与不同细胞Marker的共定位。

结 果

一、TLR4高表达于小脑蒲肯野细胞层

通过免疫荧光染色的方法，可发现TLR4在小脑组织中高表达于PL，而在ML和GCL中则没有明显的表达。而后通过与蒲肯野细胞特异的标记蛋白——钙结合蛋白共染发现TLR4高表达于钙结合蛋白阳性的蒲肯野细胞胞浆中，而在树突分支中则没有表达。详细信息见图1。

图1 免疫荧光染色检测Toll样受体4在小脑蒲肯野细胞中的表达

二、TLR4在伯格曼胶质细胞和小脑颗粒细胞中的表达

通过免疫荧光共染，发现Sox2阳性的伯格曼胶质细胞（图2）和NeuN阳性的颗粒细胞中均没有TLR4 的表达（图 3）。

三、TLR4在小脑小胶质细胞中的表达

将TLR4与小胶质细胞特异的标记蛋白——Iba-1进行共染，结果发现只有极少部分的小脑小胶质细胞表达TLR4（图4）。

四、TLR4在TLR4-/-小鼠小脑组织中的表达

采用TLR4-/-的小脑组织进行阴性对照染色，结果发现TLR4抗体在TLR4-/-的小脑组织中未见明显阳性表达信号（图5）。

讨 论

图2 免疫荧光染色检测Toll样受体4在小脑伯格曼胶质细胞中的表达；图3免疫荧光染色检测Toll样受体4在小脑颗粒细胞中的表达；图4免疫荧光染色检测Toll样受体4在小脑小胶质细胞中的表达

图5 免疫荧光染色检测Toll样受体4在TLR4-/-小脑组织中的表达

TLR4不仅是免疫调节的关键分子，同时也是调节中枢神经系统功能的重要分子，其广泛参与神经性疼痛以及神经退行性病变[9，10]。通过减轻炎症反应，TLR4还能够保护缺血性损伤所致的海马神经元凋亡，参与海马区的神经可塑性调节和神经发生[7，11，12]。 这些研究揭示了 TLR4 在神经系统中的非免疫性功能，且一定程度上预示了TLR4在神经系统功能发挥中的重要作用，然而以上研究主要集中于中枢神经系统的大脑部分，对于小脑的研究却未曾被揭示。

小脑的功能主要是调节运动平衡和协调动作的执行，而这其中最关键的细胞是蒲肯野细胞，是小脑皮层中唯一的信号输出神经元，对于小脑功能的执行有着不可替代的作用[13-16]。本实验率先发现了TLR4高表达于小脑的蒲肯野细胞中，这预示了TLR4在小脑功能执行中可能发挥了重要的作用。蒲肯野细胞的胞体位于PL，然其树突发出的分支却伸向ML，远端的树突分支与颗粒细胞轴突上行到分子层形成平行纤维-蒲肯野细胞突触连接；而近端树突分支则与延髓橄榄核发出的攀缘纤维形成攀缘纤维-蒲肯野细胞突触连接。蒲肯野细胞通过以上两种突触连接接收兴奋性信号的输入，经整合之后输出到前庭小脑核和深部小脑核，以完成小脑功能的执行[17]。因此，颗粒细胞对于蒲肯野细胞为核心的小脑功能执行也有着重要的作用。而在小脑的PL中，伯格曼胶质细胞作为蒲肯野细胞的“邻居”，其发出的胶质纤维进入ML与蒲肯野细胞的树突分支紧密连接，形成支架样的作用供蒲肯野细胞树突分支的延伸，进而保证蒲肯野细胞充分的突触连接以发挥其功能，因此伯格曼胶质细胞对于蒲肯野细胞的功能执行也有着非常重要的作用[18]。本实验同样分析了TLR4在颗粒细胞和伯格曼胶质细胞中的表达，结果证实TLR4并没有表达于颗粒细胞和伯格曼胶质细胞中。初步判断TLR4在小脑功能执行中的作用主要是通过影响蒲肯野细胞来实现的。

先前大量研究证实，TLR4作为免疫反应过程中的信号转导蛋白，在小胶质细胞中表达。本实验同样分析了TLR4在小脑小胶质细胞中的表达，结果显示只有极少部分的小胶质细胞中有TLR4的表达，这说明TLR4在小脑中的作用可能并未明显涉及到免疫相关，反而其非免疫性的神经功能值得更深入的研究。为了进一步证实，笔者采用了TLR4-/-的小脑组织进行对照染色，结果发现TLR4抗体在TLR4-/-的小脑组织中未见明显阳性表达信号，这既验证了所用抗体的特异性，也证实了以上结果的可靠性。

综上所述，本研究将免疫反应调节中的经典信号分子TLR4进行了小脑组织学表达情况的初步探索，明确了其高表达于蒲肯野细胞，这对于后期揭示其在小脑功能中的作用具有重要的启示作用，同时对于探索TLR4在神经系统中的非免疫性作用也有重要的意义。