高效液相色谱法检测黄瓜中的胶霉毒素

毛黎娟，章初龙

(浙江大学 a农生环测试中心,b生物技术研究所，浙江 杭州 310058)

真菌在谷物或其他食品中生长繁殖时会产生真菌霉素，当人或动物食入这种霉变的谷物或食品时发生中毒现象，即为真菌性食物中毒。真菌毒素是食品链中的隐形杀手，著名的真菌毒素有黄曲霉毒素、镰刀菌毒素。

胶霉毒素是烟曲霉产生的真菌毒素之一[1-6]，具有免疫抑制活性和抗菌活性。除了烟曲霉以外，青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma)等很多真菌都可以产生胶霉毒素。欧盟302/2 014号法规批准由里氏木霉菌株CBS 126896生产的内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶制备物可作为饲料添加剂使用，但加拿大等规定产真菌毒素的生产菌不能用作饲用酶制剂生产菌。同时，木霉还是常用的植物病害生防真菌，一些木霉种，如绿木霉(T.virens)会产生胶霉毒素[7]。但迄今关于在农作物上使用生防木霉菌是否会导致农产品中胶霉毒素残留仍未明确。因此，建立胶霉毒素的定量分析方法对于检测谷物或食品中的胶霉毒素残留，以及分析真菌产胶霉毒素的能力等都是非常必要的。

Romer Labs@建立了针对胶霉毒素的基于薄层层析(TLC)的定量检测方法，可用于谷物、饲料等样品中胶霉毒素的半定量检测，国内也有研究人员对人体细胞和烟曲霉共培养液中的胶霉毒素进行检测、对产胶霉毒素的真菌菌株进行分离鉴定等，但还未见对粮食或蔬菜中胶霉毒素进行测定的报道。为此，拟建立适合于黄瓜中胶霉毒素残留检测的高效液相色谱(HPLC)定量分析方法，以期为相关研究及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试材与仪器试剂

供试材料为市售黄瓜。

仪器：Delta 600高效液相色谱仪，美国Waters；Tissuelyser-24全自动样品快速研磨仪，中国上海净信科技；3K15台式高速离心机，德国Sigma；分析天平，中国上海梅特勒-托利多仪器有限公司；超声波清洗器，中国上海科导超声仪器有限公司。

试剂：甲醇、乙腈均为色谱纯，德国Sigma；试验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 方法

1.2.1 对照品储备液制备

胶霉毒素标准品购自Romer Labs@，浓度101.0 μg·mL-1，4 ℃避光保存。准确移取1.0 mL置于10.0 mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，即得对照品储备液(含胶霉毒素10.10 μg·mL-1)。

1.2.2 供试品处理

取黄瓜500 g，去蒂。将可食用部分切碎，用组织粉碎机将样品加工成浆状，均匀分成若干份，分装入洁净盛样袋内，密闭，标记。准确称取0.5 g均匀试样置于5 mL的具塞刻度塑料离心管中，准确加入2.0 mL 84:16(体积比)乙腈-水溶液，加入5颗陶瓷珠，用全自动样品快速研磨仪65.00 Hz快速提取180 s，重复提取4次。先以9 000 r·min-1离心15 min，取上清，再以12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，即得供试品溶液。

1.3 液相色谱条件

分析柱：XBridge C18，内径5 μm，4.6 mm×250 mm(宽pH值范围)，柱温35 ℃；流动相：A相为水，B相为甲醇。梯度洗脱程序：0 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比50∶50；15.00 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比50∶50；15.10 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比25∶75；20.00 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比10∶90；25.00 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比50∶50；35.00 min，流速1.0 mL·min-1，流动相A与流动相B体积比50∶50。检测条件：流速1.0 mL·min-1，进样体积20 μL，检测器为Waters 2998二极管阵列检测器。

1.4 测定方法

取对照品溶液及供试品溶液20 μL进行液相色谱分析，记录色谱图。采用标准曲线法计算样品中胶霉毒素的含量。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂

分别选用84∶16(体积比)的乙腈-水溶液与70∶10∶20(体积比)的甲醇-水-正己烷溶液提取黄瓜中的胶霉毒素。结果显示，在相同质量的黄瓜中加入相同体积的提取溶剂，都能满足提取需要，但是甲醇-水-正己烷溶剂体系不互溶，增加了操作步骤；因此，本试验采用84∶16(体积比)的乙腈-水溶液作为提取溶剂，进行胶霉毒素提取。

2.2 色谱条件

2.2.1 流动相比例

流动相由甲醇和水组成，随甲醇浓度的增加，胶霉毒素保留时间减小。如果胶霉毒素浓度太大，与杂质峰不能实现基线分离；如果胶霉毒素浓度太低，则峰宽变大，保留时间太长。本试验对流动相比例、浓度、流速等条件进行筛选，最终采取梯度洗脱的方法。在该梯度条件下，杂质峰和胶霉毒素色谱分离良好，且可减少数据采集时间，保护色谱柱。

2.2.2 检测波长

以10.10 μg·mL-1胶霉毒素标准溶液在1.3节的流动相条件下在210～400 nm波长进行扫描，结果显示，最大吸收峰为269 nm。故采用269 nm作为检测波长进行定量分析(图1)。

A，检测波长210～400 nm的检测结果；B，出峰时间为9.348 min 时210～400 nm的检测图谱；C，出峰时间为9.348 min、 269 nm检测波长下的HPLC色谱图1 胶霉毒素标准溶液的检测图谱

2.3 专属性

在上述试验条件下，经预处理的黄瓜样品中其他物质不干扰胶霉毒素的测定(图2)，可见该方法专属性良好。

2.4 线性关系

分别精密移取对照品储备液适量，用流动相作为稀释液进行稀释，并配制胶霉毒素浓度分别为0.101、0.202、0.505、1.01、2.02、5.05、10.1 μg·mL-1的系列标准溶液，进行高效液相色谱分析。以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=9788.9X+537.45，R2=0.997 9。结果表明，胶霉毒素在0.101～10.10 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 检测限和定量限

以3倍信噪比所对应的浓度作为检测限，以10倍信噪比所对应的浓度作为定量限，结果显示，本试验方法的检测限与定量限分别为0.101、0.202 μg·mL-1，相当于取样量为0.5 g时，样品中对应的胶霉毒素含量分别为0.4、0.8 mg·kg-1。

A、B、C、D分别为空白、对照、样品和样品加标图2 黄瓜中胶霉毒素的高效液相色谱检测结果

2.6 精密度

分别取对照品溶液0.101、1.01、5.05 μg·mL-1，按照色谱条件连续进样，测定5次，计算峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)，平均值为2.5%，表明胶霉毒素测定精密度良好。

2.7 稳定性

取新制备的0.101、1.01、5.05 μg·mL-1的对照品溶液，室温下棕色瓶中密封避光保存，分别保存0、4、12、16、36、42、124、130 h进样(表1)，检测结果的RSD分别为3.3%、3.4%、2.1%，表明胶霉毒素溶液稳定性良好，但尽快进样的测定结果更可靠。

表1 胶霉毒素的稳定性试验结果

2.8 重复性

分别称取同批次黄瓜约0.5 g，加入胶霉毒素对照品溶液(胶霉毒素浓度为101 μg·mL-1)10.0 μL，制成含1.01 μg的样品，按1.2.2节方法平行制备6份供试品溶液，按照1.3节色谱条件进行测定，测定的胶霉毒素含量分别为2.033 7、1.952 3、2.191 7、2.115 2、1.998 2、2.180 0 mg·kg-1，计算样品胶霉毒素含量的RSD为4.8%。

2.9 回收率

取无胶霉毒素残留的黄瓜空白样品各0.50 g，分别加入胶霉毒素对照品溶液(胶霉毒素浓度为101 μg·mL-1)5.0、10.0、20.00 μL，制成含低中高3种浓度的样品，每个浓度样品平行3份，按照前述方法进行测定，计算回收率。黄瓜中胶霉毒素的平均回收率分别为106.3%、103.2%和105.5%，RSD分别为1.4%、3.7%和5.0%(表2)，符合检测要求，可满足黄瓜样品中含低中高浓度的胶霉毒素残留的检测要求。

表2 黄瓜样品中胶霉毒素加标回收率及精密度

3 小结

建立黄瓜中胶霉毒素的HPLC定量分析方法，与Romer Labs@建立的胶霉毒素TLC定量检测方法相比，该方法操作简便、灵敏度高、专属性强，能较准确地测定胶霉毒素残留量。该方法测定黄瓜中胶霉毒素含量的线性范围为0.101～10.1 μg·mL-1，检测限为0.101 μg·mL-1，回收率99.5%～108.6%，对黄瓜样品进行测定的RSD为1.4%～5.0%，可用于黄瓜样品中胶霉毒素残留量的检测。