硫化氢对顺铂诱导近端肾小管上皮细胞凋亡的干预研究*

杨波，倪倩，朱艳，赵欢顺，杨成，段绍斌，蒋云生

（1.南华大学附属第一医院 肾内科，湖南 衡阳 421001；2.长沙医学院 临床系，湖南 长沙 410219；3.中南大学湘雅二医院 肾内科，湖南 长沙 410011）

硫化氢（sulfuretted hydrogen,H2S）目前被誉为除一氧化氮和一氧化碳的体内第3种气体分子，其在多种生理病理过程中担任着重要的角色，具有调节突触活动、舒张血管及抑制红细胞氧化等重要生理功能。H2S可直接清除过氧化氢和超氧阴离子，具有强大的抗氧化功能。在机体内，H2S的功能多样，包括对抗化学性损伤，抑制化学性损伤所致心肌细胞和神经细胞的凋亡作用[1]。

顺铂（Cisplatinum,DDP）是广泛用于人类肿瘤化疗的一种药物，其抗肿瘤细胞作用主要是因为其与增值细胞DNA的结合特性。然而顺铂又与许多正常细胞有亲和性，从而导致毒性，比如肾毒性、神经毒性、耳毒性、催吐性[2-3]，故其在化疗治疗中因其诸多的副作用被限制使用。而在这些副作用中，肾毒性被认为是限制其临床应用的主要方面[4-5]。使用高剂量顺铂化疗患者，20%出现肾功能不全，顺铂导致的肾毒性主要表现在小管间质性损害[2-3]。在动物模型中，顺铂主要损害近端小管。由于顺铂在肿瘤化疗中的重要地位，有很多研究寻找相应保护方法以减轻其肾毒性。在临床前期研究中，提示抗氧化剂可以减少顺铂导致的肾毒性。

H2S对于顺铂导致的近端肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cell,HK-2细胞）是否有保护作用，目前尚未见报道。本实验用H2S进行干预，探索其对HK-2细胞是否有抗凋亡的作用，以寻求抗细胞凋亡的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）（美国ATCC公司），胎牛血清为四季青（浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司），二甲基亚砜（Dmethyl sulfoxide,DMSO）（美国Sigma公司），顺铂为诺欣（江苏豪森药业股份有限）公司，硫氢化钠NaHS（上海紫一试剂厂）。噻唑蓝[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]（美国Amresco公司），Annexin V-FITC/PI试剂盒（上海前程生物科技有限公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），6、24和96孔细胞培养板（美国Coring公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDP、NaHS的配置 将DDP配制成1 mg/ml溶液，过滤除菌分装，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。将NaHS配制成16 mmol/L溶液，过滤除菌分装，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 MTT实验 ①阴性对照组：加入等体积培养基；DDP组：0、1、2、5、10、20和40 mg/L；DDP+NaHS组：0 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.2 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.4 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+0.8 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS、20 mg/L DDP+2.0 mmol/L NaHS。②将生长至对数期HK-2细胞调整密度为1×104个/ml。③加入96孔板，每孔100 μl，阴性对照组（加入等体积培养基）设置调零孔，对照孔，边缘使用PBS填充。④在5%二氧化碳CO2，37℃培养，至细胞单层铺满孔底（24 h），加入上述梯度浓度药物，每孔100 μl，设立5个复孔。⑤每孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4 h。⑥终止培养，吸弃孔内培养液，使用PBS清洗2、3遍。⑦每孔加入100 μl DMSO，酶联免疫检测仪测量各孔的光密度（optical density,OD）值。细胞存活率（%）=（实验孔OD均值-空白孔OD均值）/（对照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。

1.2.3 DAPI、Annexin V/PI染色检测HK-2细胞形态学变化 ①调整HK-2细胞密度为1×105个/ml，接种于24孔板（板底铺盖玻片），每孔1 ml。②待细胞贴壁后，根据实验分组，予以不同干预，设3个复孔，培养24 h。③吸弃上清，使用PBS清洗3遍。④使用双蒸水稀释，将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer工作液，每孔加500 μl工作液重悬细胞。⑤每孔加入 2.5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，1 μl DAPI。⑥轻柔涡旋混匀，室温避光5 min。⑦使用荧光显微镜观察。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率 ①调整HK-2细胞密度为5×105个/ml，接种于6孔板，每孔2 ml。②待细胞贴壁后，根据实验分组，予以不同干预，并设置不加干预因素的流式对照，一组无染色剂，一组只有Annexin V-FITC，一组只加PI，每组设3个复孔，培养24 h。③培养结束，使用胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，使用PBS清洗2遍。④使用双蒸水稀释，将5×Binding Buffer稀释为1×Binding Buffer工作液，每管加500 μl工作液重悬细胞，调整细胞密度为5×105个/ml。⑤每管加入2.5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。⑥轻柔涡旋混匀，室温避光5 min。⑦进行流式细胞术分析。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单位因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的OD值比较

使用0～40 mg/L顺铂对细胞进行处理，结果显示：各组的OD值比较，差异有统计学意义（F=7.969，P=0.000）。20 mg/L DDP组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=3.640，P =0.007）。而加用NaHS后，细胞的OD值有所上升，呈剂量改变，在NaHS为0.5 mmol/L时差异有统计学意义（t=-4.741，P =0.001）。但当NaHS浓度为0.5～1.0 mmol/L，3组间OD值差异无统计学意义（t=0.024，P =0.977）。当NaHS为2.0 mmol/L时，OD值较1.0 mmol/L下降（t=3.785，P =0.005）。

2.2 各组HK-2细胞凋亡比较

荧光显微镜下，20 mg/L DDP和HK-2细胞作用24 h后，出现凋亡小体，表现为核固缩，核碎裂，形成大小不等的染色小体，但其包膜完整。DAPI染色即显示出染色加深，Annexin-V FITC将凋亡细胞细胞膜染色成绿色（早期凋亡），PI可将核染色成红色（晚期凋亡）。当加入NaHS后，与DDP组比较，凋亡细胞减少，成剂量依赖性，浓度越大，凋亡细胞越少。20 mg/L DDP组平均凋亡细胞，与阴性对照组比较差异有统计学意义（t=-14.130，P =0.000）。加入NaHS后，随浓度上升凋亡细胞减少，1.0 mmol/L NaHS+20 mg/L DDP组与20 mg/L DDP组比较差异有统计学意义（t=11.121，P =0.000）。见图1、2和表1。

2.3 各组细胞凋亡率比较

活细胞FITC/PI均为低染（位于左下区），凋亡细胞FITC高染而PI低染（位于右下区），坏死细胞FITC/PI均高染（位于右上区）。DDP组凋亡率与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=11.121，P =0.000）。DDP组高于阴性对照组。加NaHS后，凋亡率下降，差异有统计学意义（t=9.320，P =0.001）。随着NaHS浓度增大，凋亡率降低，20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS组与20 mg/L DDP+0 mmol/L NaHS组比较，凋亡率差异有统计学意义（t=4.568，P =0.010）。见表2和图3。

图1 NaHS、DDP对HK-2细胞凋亡的影响 （DAPI染色×400）

图2 NaHS、DDP对HK-2细胞凋亡的影响 （Annexin V/PI染色×400）

表1 DDP、NaHS对HK-2细胞凋亡的影响（n=8，个，±s）

表1 DDP、NaHS对HK-2细胞凋亡的影响（n=8，个，±s）

组别 凋亡细胞阴性对照组 4.23±1.015 20 mg/L DDP组 35.02±6.079 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS组 22.55±2.912 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS组 9.78±2.063 F值 119.353 P值 0.000

表2 NaHS、DDP对HK-2细胞增殖的影响（n=3，±s）

表2 NaHS、DDP对HK-2细胞增殖的影响（n=3，±s）

组别NaHS/（mmol/L）凋亡率/%阴性对照组 0 5.167±0.612 20 mg/L DDP组 0 31.598±1.014 20 mg/L DDP+0.5 mmol/L NaHS组 0.5 18.375±2.239 20 mg/L DDP+1.0 mmol/L NaHS组 1.0 11.636±1.233 F值 193.344 P值 0.000

图3 NaHS、DDP对HK-2细胞凋亡的影响

3 讨论

肾脏疾病作为多发病和常见疾病，有很高的患病率。有最新的流行病学资料显示，我国慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患病率为10.8%。原发或继发性因素引起急性或慢性肾损伤。当病程超过3个月，则变为不可逆的慢性肾衰竭。WHO称每年新增肿瘤患者1 400万。20世纪70年代以来，DDP已被广泛用于治疗多种恶性肿瘤，其中包括睾丸癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、头颈部恶性肿瘤，以及小细胞和非小细胞肺癌等，是治疗实体肿瘤最有效和常用的临床药物之一。但由于对正常组织中的严重不良反应常限制了其临床应用。DDP不良反应有肾毒性、耳毒性、骨髓抑制、胃肠道毒性、变态反应等[6-7]，其中肾毒性最常见，约1/3患者出现急性肾损伤[6，8-9]，其剂量相关的肾毒性极大限制了临床应用。肾脏毒性主要发生在肾脏近端小管上皮细胞，神经毒性主要影响神经上下级，耳毒性主要影响耳蜗中掌握机械感觉的外毛细胞。这些都大大限制了DDP的应用。肾脏损伤常常发生于使用标准处方量的DDP治疗几天后[10-14]，血清肌酐和血清尿素氮水平有所增加。这种肾脏损害可以导致阳离子的浪费，进而发生糖尿和蛋白尿。DDP治疗过程中最常发生的并发症是低镁血症。在持续DDP治疗中，可能会发生进展性和永久性肾脏损害。目前有不少学者正在研究DDP的肾毒性发生机制，寻找防治方法及药物。

H2S是一种有毒气体，其无色、易溶于水，带有特殊气味。其在1777年由一个年轻的瑞典药商命名，在后来的几百年都被认为是一种有毒的气体。它的最大暴露值（PEL）为10 ppm，当浓度＜400 ppm时可以导致人骤然死亡。现在H2S被认为是第3种气体分子。半胱氨酸的脱巯基酶是哺乳动物H2S的主要来源。该过程是被CBS和CSE催化。CBS在大脑中的很多区域表达，特别是中枢神经系统[15-16]。而CSE主要在循环系统表达[17]。文献指出，H2S对神经系统保护[18-19]、循环系统保护[20-21]都有很多作用。H2S被认为的主要机制是抗氧化作用，这也是研究的一大热点。H2S是强大抗氧化剂，可保持内环境稳定，有时也是强大的促氧化剂，可以通过ROS活化杀灭肿瘤细胞[22]。它被发现有两个截然不同的分子机制，抗氧化性和促氧化性，而表现出哪个方面，取决于当时的内环境。简单归纳说，H2S可以表现出很多益处，比如对心血管系统的保护作用。而更深层次地说，还可以表现出毒性/细胞毒性效应。

通过研究发现，H2S参与氧化应激效应并不是通过单纯的机制，其中有多种信号通路参与。H2S可以通过多种酶类或者非酶类的抗氧化剂清除自由基。H2S也会抑制线粒体ROS产生，通过抑制p66Shc巯基。也可以通过它的化学特性减少氧自由基，其机制十分复杂。

本实验MTT比色法检测DDP的浓度与HK-2细胞培养，随DDP浓度上升，OD逐渐下降，示细胞凋亡增加，发现在DDP为20 mg/L时，细胞生长被抑制，显示DDP对HK-2细胞的毒性作用，随剂量增加而加重，与剂量呈正相关。在DDP为20 mg/L联合使用NaHS后，细胞凋亡减少，并且NaHS上升后，细胞凋亡逐渐减少。提示H2S可以减轻DDP对细胞的毒害，并且与浓度有关。但在NaHS＜1 mmol/L时，对HK-2细胞的保护作用下降，NaHS保护作用下降的机制有待进一步研究。

在DAPI染色和Annexin V-FITC/PI染色，早期凋亡会出现细胞膜被染成绿色，晚期凋亡则是胞核也可以被染成红色。实验显示见DDP组的细胞凋亡率高于阴性对照组，在加用NaHS后，凋亡率有所下降，并且与剂量相关。Annexin V-FITC/PI流式细胞术可更准确地反映凋亡情况，可在不同象限更直观精确地反映。在流式细胞术中，可以明显看见DDP组凋亡，而加用NaHS后，凋亡明显减少，呈剂量依赖性。

氧化还原系统的平衡，对细胞的生存能力和功能有至关重要的作用，是由两个抗氧化系统组成（谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统）组成的。活性氧系列是细胞新陈代谢正常副产物，比如线粒体新陈代谢或者蛋白质折叠均可产生。硫氧还原蛋白系统，包括硫氧还原蛋白、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在细胞氧化还原信号转导里扮演着一个重要的角色生长和细胞凋亡。除了氧化还原调控胞内信号，系统也发挥其直接抗氧化防御氧化应激，包括清除活性氧（ROS），减少过氧化物和内源性抗氧化剂回收。DDP导致的细胞凋亡和ROS导致的p53活化有关，而H2S也会抑制线粒体ROS产生，通过抑制p66Shc巯基。但是H2S是否是通过这个通路来抑制DDP对细胞的毒性，仍需进一步研究。当NaHS浓度＜1 mmol/L时，对细胞的保护作用下降，可能与此有关。

DDP导致的肾损伤机制涉及多种途径，如炎症介质、氧化应激、坏死及凋亡、自噬等，目前仍不清楚这些因素最终整合导致肾损伤的具体机制。本实验显示H2S对DDP导致的HK-2细胞凋亡有保护作用，但是在人体内，机制仍不清楚。且需要考虑内源性H2S的作用及药物的分布等。因此对于其进一步应用，须继续大量体外及体内实验观察。进一步研究既保护正常组织，又不影响DDP抗肿瘤治疗的方法，将有助于DDP在临床抗肿瘤治疗中的广泛应用。