大蒜辣素和阿藿烯的制备工艺研究

唐铁鑫，刘 慧，邓礼荷，邱新华

（肇庆医学高等专科学校 药学系，广东 肇庆 526040）

关键字：大蒜辣素；阿藿烯；合成；纯化

大蒜（Allium sativumL.）广泛用于药品、食品和饲料添加剂[1-3]。大蒜中蒜氨酸被蒜酶催化分解产生大蒜辣素（allicin），再分解成阿藿烯（ajoene）等含硫有机化合物，有抗病原微生物、抗肿瘤、抗心血管疾病等作用[4-6]。美国、英国及欧盟药典以蒜氨酸或大蒜辣素作为大蒜粉的含量测定指标[1,7]。《中国药典》采用大蒜素（alltride）作为大蒜含量测定指标，但该指标存在异议[1,8]。直接以大蒜为原料制备分离大蒜辣素、阿藿烯，成本高、难度大[4,7,9-11]。以烯丙基二硫化物为原料可合成大蒜辣素[4,10]，用大蒜辣素可合成阿藿烯[4]，本文研究相关工艺改进。

1 材料

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪（美国安捷伦）；LC 10A高效液相色谱仪（日本岛津）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛晶玻实验仪器厂）；CPA225D十万分之一精密分析天平（德国赛多利斯）；PURELAB flex3超纯水仪（英国ELGA）；CXG-A电脑恒温层析柜（广州恒创）；RE52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TF-FD-1L实验室真空冷冻干燥机（上海田枫）。

1.2 药品与试剂

80 %烯丙基二硫化物（allyl disulfide）、对羟基苯甲酸丁酯（butyl parahydroxybenzoate，分析对照品，纯度＞99.5 %）（上海阿拉丁），分析纯甲酸、冰乙酸、30 %过氧化氢、氢氧化钾、丙酮、甲醇、二氯甲烷、正己烷（广州化学试剂厂），色谱纯的甲醇和乙腈（瑞典Oceanpak），超纯水（实验室制备）。大蒜（市售），研碎后冻干制成。

2 方法与结果

2.1 大蒜辣素和阿藿烯的检测

参考《英国药典》大蒜粉中大蒜辣素含量测定方法[12]检测大蒜辣素，但在等度洗脱9 min后增加一个梯度洗脱过程，检测弱极性物质且避免前一次样品分析残留的成分干扰下一次样品分析。

色谱柱为安捷伦ZORBAX色谱柱-SB-C18（5µm，150 mm×4.6 mm），流动相A为1 %甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇，0～9 min，60 % B；9～12 min，线性增至80 % B；12～18 min，80 % B；18～20 min，线性递减至60 % B；20～22 min，60 %B。流速0.8 ml/min，紫外检测波长254 nm，进样量5 µl。

取对羟基苯甲酸丁酯对照品20.5 mg，精密称定，加甲醇-水（1:1）溶液溶解转移入100 ml量瓶，稀释定容，作为内标溶液。按1 mg 对羟基苯甲酸丁酯对应8.65 mg大蒜辣素计算含量[12]。按照文献[12]方法制备大蒜粉供试品溶液，合成大蒜辣素样品和合成阿藿烯样品按各试验项下的具体方法制备。

主要样品和对照品的色谱图见图1，测得每1 g大蒜粉中含有3.92±0.01 mg（n=2）大蒜辣素。

图1 实验中主要样品和对照品的色谱图

2.2 大蒜辣素合成研究

取烯丙基二硫化物0.7 ml溶于冰乙酸，定容至5 ml，置冷浴（0 ℃）中冷却。在快速搅拌下，将5 ml过氧化氢乙酸溶液（0.7 ml 30 %过氧化氢溶解于5 ml冰乙酸中）逐滴加入烯丙基二硫化物乙酸溶液中反应，反应完后继续在冷浴下快速搅拌4 h，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入100 ml量瓶，稀释定容至刻度；再分别吸取0.2 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml内标溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀释定容，用0.45 µm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液进行测定。另外一组试验中，反应完后继续于20 ℃快速搅拌，分别于1，2，4，6 h准确取样0.2 ml，分别加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀释定容至刻度；再分别吸取5 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml内标溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀释定容，然后测定。

结果，冷浴中反应4 h反应生成大蒜辣素129.3±7.0 mg；于20 ℃分别反应1，2，4，6 h，分别生成大蒜辣素：147.6±1.1 mg，207.3±2.2 mg，271.3±10.0 mg，353.1±2.6 mg（n=2）。以时间（T/h）为横坐标、产物质量（M/mg）为纵坐标对数据进行曲线拟合，得到直线拟合方程为M＝39.55×T＋116.3，R2＝0.9905，反应符合零级反应动力学方程。反应6 h后，烯丙基二硫化物基本消耗完毕（图1 B）。

2.3 大蒜辣素纯化制备

取烯丙基二硫化物0.7 ml，按2.2项于20 ℃反应6 h合成大蒜辣素粗品，参照文献[9]，在快速搅拌和冰浴冷却条件下，通过滴入氢氧化钾溶液（2.15 g氢氧化钾溶于蒸馏水，定容至2.5 ml）中和反应混合物，如有盐析出，加适量水溶解，分别加入等体积的正己烷、二氯甲烷各萃取一次；将未萃取的溶液、正己烷萃取后溶液和二氯甲烷萃取后溶液各取0.2 ml，分别加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀释定容至刻度测定。

测得的色谱图见图2。正己烷基本将未反应的原料和保留时间7.5 min后的成分萃取（图2 B）；二氯甲烷萃取后，溶液中大蒜辣素的含量降低（图2 C）。萃取前溶液的大蒜辣素峰的峰面积为27 221.4（按照峰面积归一化法，大蒜辣素峰的峰面积占66.7 %），正己烷萃取后减少至25 085.6，二氯甲烷萃取后减少至4421.2。正己烷萃取一次使溶液中大蒜辣素减少约7.8 %，而二氯甲烷萃取一次使溶液中大蒜辣素减少约82.4 %。因此，可用正己烷除去未反应的原料，用二氯甲烷萃取纯化大蒜辣素。

取二氯甲烷层1 ml减压挥去溶剂，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀释定容至刻度测定，测得的色谱图见图1 E，按照峰面积归一化法，大蒜辣素峰的峰面积占92.2 %。

图2 液-液萃取处理对合成大蒜辣素的纯化作用

2.4 大蒜辣素热解制阿藿烯的研究

文献[4]将大蒜辣素按10 %的体积比溶于40 %丙酮水溶液中，于64 ℃反应4 h制取阿藿烯。参考该条件，将0.1 ml大蒜辣素按10 %体积比溶于溶剂中，分别进行以下单因素试验。大蒜辣素分解产生阿藿烯的图谱见图1 C。

按照文献[4]的反应温度64 ℃，分别加热1，2，4，6，8 h，反应后加甲醇-水（1:1）溶液溶解，移入10 ml量瓶，继续稀释定容至刻度；再分别吸取1 ml置入10 ml量瓶，再加甲醇-水（1:1）溶液稀释定容，用0.45 µm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液进行测定。结果，阿藿烯峰生成量分别为：3.79±0.03，3.58±0.02，3.26±0.05，3.10±0.02，3.04±0.03 mg（n=2）。以时间（T/ h）为横坐标、阿藿烯的生成量（M/mg）为纵坐标对数据进行曲线拟合，得到对数拟合方程为M＝-0.379 ln(T)＋3.807，R2＝0.9917，表明大蒜辣素于64 ℃很快生成阿藿烯，随加热时间增加，阿藿烯慢慢减少。

溶于40 %丙酮水溶液中，于30，40，50，60，80 ℃反应4 h。结果，阿藿烯生成量分别为：1.49±0.04，2.50±0.04，4.33±0.04，4.80±0.01，4.07±0.01 mg（n=2），60 ℃下反应生成量最高。

不加溶剂、溶于甲醇-水（1:1）水溶液、溶于甲醇中，于64 ℃反应4 h。结果，阿藿烯峰的峰面积分别为：1.25±0.06，3.51±0.01，5.75±0.03 mg（n=2）。

2.5 阿藿烯的纯化制备

根据2.4项结果，选择将0.1 ml大蒜辣素按10 %的体积比溶于甲醇中，在60 ℃下加热1 h，用甲醇-水（1:1）溶液稀释，用0.45 µm微孔滤膜过滤，用反相高效液相色谱法分离制备阿藿烯。其中，色谱柱为Innoval C18半制备色谱柱（5 µm，100 Å，10 mm×250 mm），流动相为甲醇－水（6:4），紫外检测波长254 nm，每次进样量为100 µl。柱后收集富含阿藿烯的洗脱部分，加食盐至成饱和溶液，以二氯甲烷为溶剂萃取，二氯甲烷层加无水硫酸钠脱水，低温减压挥去溶剂。纯化后的阿藿烯产品的色谱图见图1 F，按照峰面积归一化法，阿藿烯峰的峰面积占98.8 %。经测定，产物的质谱ESI-MS MRM(+)：m/z234.9；红外光谱γ/cm-1：3080～2905, 1634, 1611, 1422, 1042 cm-1；核磁共振谱氢谱1HNMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.57 (d),5.9 (m), 5.4 (m), 5.2 (m), 3.5 (m), 3.38 (m)；核磁共振谱碳谱13CNMR （500 MHz，CDCl3）：δ134.58,132.47, 125.52, 123.77, 119.20,117.88, 54.79, 52.84,41.99，与文献中阿藿烯波谱数据基本一致[4]。

3 讨论

实测结果表明，大蒜冻干粉中大蒜辣素的含量不到0.4 %。用大蒜制备大蒜辣素，成本高、干扰成分多、分离纯化较困难。化学合成方法制备大蒜辣素，转化率高、干扰成分少[4,10]。

将烯丙基二硫化物氧化成大蒜辣素的反应，文献[10]报道13 ℃下反应呈零级反应动力学，20 ℃时也为零级反应。因此，在一定温度下反应足够时间，使原料反应完全，大蒜辣素不再增加；由于大蒜辣素不稳定，随后会分解减少。文献建议温度为10～30 ℃，但冰浴中反应也产生了相当于20 ℃下三分之一的大蒜辣素，表明即使在低温下也能反应生成产物。低温下有利于避免分解，但反应时间长且温度控制需增加设备和能耗，实际制备中可根据具体情况控制温度和反应时间。

由于大蒜辣素易分解，分离纯化成为制备较高纯度大蒜辣素的关键。文献中采用乙醚萃取大蒜辣素[10]，乙醚易燃易爆，接触空气会慢慢氧化成过氧化物，过氧化物不稳定，加热易爆炸，要避光严封保存，而且属于易制毒二类溶剂，因此试验用二氯甲烷替代。通过液-液萃取方法，用正己烷除去未反应的原料，用二氯甲烷萃取富集大蒜辣素，取得较佳纯化效果。由于用制备液相色谱法进一步制备成本高，大蒜辣素在除去溶剂的过程分解（结果表明，30 ℃下均分解产生阿藿烯），因此不再进一步纯化。

大蒜辣素在不同温度下，在不同溶剂中，甚至不加溶剂均分解产生阿藿烯等一系列产物。64 ℃下加热，反应1 h产生的阿藿烯最多。但时间增加，阿藿烯的量下降较慢，表明阿藿烯稳定性较好。文献[4]报道用40 %丙酮作为溶剂溶解大蒜辣素进行热裂解，考虑到丙酮为易制毒溶剂，因此试验不加溶剂、甲醇水溶液和甲醇进行反应，结果表明，甲醇中反应产量更高。文献中热裂解产生阿藿烯后，再以二氯甲烷为溶剂通过反复多次液-液萃取进行富集，挥去溶剂后再通过正相HPLC法制备[4-5]。由大蒜辣素液-液萃取试验结果可见，二氯甲烷萃取并不能将阿藿烯与原料分开，而正相HPLC也不常用，因此，改用稀释后直接通过反相HPLC法制备。

以烯丙基二硫化物合成大蒜辣素并进一步合成阿藿烯，条件要求不高，易于在实验室开展。此法可用于为研究大蒜及其制品的质量控制和药理研究提供标准物质。