3D生物打印技术在皮肤科的应用研究进展

沈婷婷 高慧

[摘要]精准医学是新世纪医学发展的重要方向，而3D生物打印技术得益于转化医学的兴起和迅速发展，通过个性化、定制化的生产在临床实践中挽救了许多人的生命。3D生物打印技术在医学领域的广泛应用已远远超出了我们的想象，如今在皮肤科及相关领域也倍受关注。本文将重点阐述3D生物打印技术的原理和其在皮肤血管、干细胞、细胞外基质等方面的演变，以及在皮肤病模型方面的潜在临床应用，并探讨其目前的局限性和未来的研究方向。

[关键词]3D皮肤生物打印；皮肤病学；演变；临床应用

[中图分类号]R785 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）06-0155-03

Abstract： Accurate medicine is the important direction of medical development in the new century， and thanks to the rise and rapid development of translational medicine 3D-biological-printing has saved many lives in clinical practice through personalized and customized production.3D-biological-printing technology in the wide range of application in the field of medicine has gone far beyond our imagination， now it has also gained considerable attention in dermatology and other related fields. This article will focus on the principle of 3D-biological-printing，and its technological breakthroughs in skin blood vessels，stem cells and extracellular matrix as well as its potential clinical application in skin-disease-related model. At last， I will discuss its current limitation and research direction in the future.

Key words： 3D skin bio-printing； dermatology； evolution； clinical application

皮膚是人体最大的器官，它覆盖于人体表面，具有屏障、吸收、感觉、分泌和排泄、体温调节和免疫等多种功能，对保护体内环境的稳定十分重要。皮肤的这些作用在中毒性表皮松解症、大面积的慢性皮肤溃疡、严重烧伤以及巨大皮肤肿瘤患者身上显得尤为重要。一方面，由于自体/异体皮肤移植的来源和应用常常受限；另一方面，目前应用较多的组织工程皮肤又缺乏表皮或者真皮成分的支持，移植后很容易出现感染和瘢痕挛缩等并发症[1]，并没有实现真正意义上的恢复皮肤完整功能。因此，积极寻找理想的生物皮肤替代品还在不断探索中。3D打印技术在制作医学模型、骨替代品、个性化假肢及假体方面已相当成熟，但是在皮肤科及相关领域的应用还处于起步阶段，本文就其在皮肤科的应用现状综述如下。

1 3D打印技术的概述

1.1 3D打印技术的概念及分类：3D打印（3D Printing）技术诞生于20世纪80年代，又称为“增材制造”[2]。其首次被应用于医学领域可追溯至20世纪90年代，医生通过3D打印技术将颅骨的CT扫描数据转化为实物模型[3]，其原理是将计算机三维数字成像技术和多层次连续打印技术相结合，简单来说就是利用重建的三维数字模型，将其分割成层状，然后逐层堆积成实体模型。

3D打印在临床上可以分为生物打印和非生物打印，3D生物打印是在3D打印基础上以活细胞及其它细胞活性成分作为打印材料，最终实现生物活性组织的打印和制作[4]，两者最大的区别就是有无细胞的参与。生物打印包括生物支架打印、细胞打印等，非生物打印包括打印医学模型、口腔种植体、假肢假体等。

1.2 3D生物打印的技术与材料：用于3D生物打印的技术[5]主要包括四种：①激光烧结打印，按照预先设定好的程序，通过计算机的控制对粉末材料进行激光加热、烧结逐层累积形成所需的模型[6]；②喷墨细胞打印，3D喷印技术是根据电流体动力学原理，使用特定的喷头，喷印流态材料，直接形成模型器件的技术[7]；③立体平板印刷打印，以液态光敏树脂为原料，通过紫外光扫描液态光敏树脂使其固化，层层叠加，形成所需模型；④微挤压成形打印，其原理是在加热器内融化热熔性材料，之后抽成丝状送进热熔喷头，在喷头内再次被融化。其应用于生物打印的主要缺点是打印出的组织中细胞存活率低。

在打印技术不断成熟的过程中，打印材料的局限性致使其无法满足医疗领域的苛刻要求，从而阻碍了3D生物打印技术更广泛地应用于临床实践。为突破打印材料的瓶颈，研究者们开展了许多相关的基础研究，近年来取得较大突破。不断有新材料应用于医学打印，从生物相容性、生物降解性、生物惰性、强度、耐久性和延展性方面考虑，如含有聚氨酯二丙烯酸酯和线性半结晶聚合物的油墨等[8]。细胞的选择是第二个重要的步骤，很多研究者关注于角质细胞（容易培养培养）和成纤维细胞（多向潜能）[9]。不同打印技术对打印材料有不同要求，一种材料可能只适合其中一种或几种打印技术[10]。

2 3D皮肤生物打印的演变

一直以来，巨大皮肤肿瘤、严重皮肤烧伤等引起的皮肤大面积缺损所致的皮肤移植免疫排斥反应等都是困扰人类的重大医学问题。鉴于目前3D打印技术的发展水平有限，打印皮肤还局限在对皮肤表层（表皮和真皮，不超过200μm）进行再造，不包括血管组织。3D生物打印人工皮肤还只是处于实验阶段，未真正应用于临床。

Binder[11]是第一个用猪的伤口模型（背部10cm×10cm的皮肤缺损）在体外打印出皮肤。他们对伤口的皮肤厚度和宽度以及皮肤替代物（包含胶原蛋白、纤维蛋白原、角质细胞以及成纤维细胞）进行激光扫描并且使用喷墨生物打印机精准输送到要求的空间。2012年，基于激光诱导前向的原理，Koch等[12]使用激光辅助技术进行生物打印，他观察到基底膜的形成，提示皮肤组织的形成有Cx43（一种缝隙连接）在膜上的表达。2013年，麦克等[13]同样利用激光辅助技术在小鼠背部完整的伤口上打印成纤维细胞、角质形成细胞和皮质醇的混合物。用Ki67染色技术显示细胞的增殖，但是缺少角质形成细胞的分化以及皮肤血管的形成。

威克森林大学再生医学研究院的研究员们研究了一种用喷墨打印技术制造皮肤薄层的方法[14]。制皮之前需要取伤者身上一块不大于邮票的皮肤组织，分析这块皮肤的层数分布后，将这块组织放置在经过消毒的喷墨盒中，研究员进行编程并输入打印机中，三维打印机将会按照程序参照供体的细胞，利用一种胶体和特殊材料，打印出与旧皮肤组织结构相同的新皮肤组织[15]。

2.1 皮肤生物打印与血管：皮肤内含有丰富血管，皮肤细胞要靠血液的供应才能存活。因此，打印血管是打印皮肤的基础。在组织工程应用中，血管的形成可以通过组织形成细胞和内皮细胞共同植入来实现，其中后者能形成功能性血管。3D生物打印技术的使用，具有改进经典组织工程方法的潜力，因为它可以允许产生具有高空间控制的内皮细胞分配的支架[16]。皮肤打印中最困难的就是实现多血管，早期企图利用血管内皮生长因子和角化细胞或支架来克服这一困难，卓有成效，但是在这个领域还需要更多研究。

德国弗朗霍夫激光技术研究所研究人员成功利用丙烯酸酯基的合成聚合物打印出血管，這种材料使得打印血管表面分布许多直径数百微米的微孔，这有利于血细胞和组织的营养交换。新近有研究人员采用喷墨打印与立体光刻相结合的方法，解决了打印只有20um厚的多孔、多分叉人造血管的关键技术[17]。

2.2 皮肤生物打印与细胞外基质：细胞外基质是表皮细胞生长和分化的内环境，如何构建这个内环境来诱导皮肤的生成，是当前国内外研究的热点[10]。汗腺在哺乳动物中发挥着重要的体温调节作用，像其他皮肤附属器一样，它们起源于表皮祖细胞，然而它们对损伤反应的再生能力低，并且是否可以指定表皮祖细胞分化成汗腺细胞谱系，这在很大程度上仍然是未知的。使用3D生物打印技术来制造功能性体外细胞负载（基于明胶和海藻酸钠的复合水凝胶）：3D细胞外基质模拟物（3D-ECM），可有效为表皮祖细胞创造限制性生态位，确保单侧分化为汗腺细胞。此外，将生物打印的3D-ECM直接递送到小鼠的烧伤爪中可有助于汗腺功能性恢复，这对于治疗深度烧伤或其他伤口至关重要[18]。

2.3 皮肤生物打印与干细胞：干细胞可以分化成内皮细胞促进血管生成，用于皮肤组织工程或者上皮本身促进上皮再生。Skardal[19]使用激光沉积生物打印技术联合具有分化成血管潜能的干细胞，发现它们极大地促进了伤口损伤后的愈合。骨源间充质干细胞通过促进血管生成、上皮化、造粒和组织形成表现出有效的体内皮肤再生，羊水干细胞由于他们的高增殖能力，更强的血管生成反应和可被忽略的免疫原性被选中。至第7天，这两种类型的干细胞都消失了，说明皮肤伤口的再生作用可能归因于干细胞生长因子的释放以及某些常驻细胞的聚集而不是干细胞分化为角质细胞或成纤维细胞。对于大面积烧伤的患者来说，寻找自体移植细胞是困难的，体外培养单种细胞，皮脂腺和毛囊的生长也受到限制。而干细胞可以自我更新并且分化成多种细胞类型。

3 皮肤病模型的潜在临床应用

潜在的皮肤病学应用包括用3D生物皮肤来开发和测试新型生物疗法，如烧伤、皮肤肿瘤、银屑病、白癜风等，此类疾病是皮肤科领域研究的热点和难点。这为备受皮肤病困扰的患者带来了佳音[4]。许多疾病以及药物的副作用都通过皮肤症状表现出来，3D生物打印等微细加工技术的最新突破使建立用于药物筛选的更可靠的体外皮肤模型成为可能。对于人体相关的药物测试通过结合不同的皮肤成分（如附属器，毛细血管，神经等）可用于皮肤疾病的药物开发[20]。最近在组织再生和皮肤烧伤治疗中具有巨大潜力的突破性技术就是3D打印[21]，通过3D打印对皮肤烧伤或皮肤肿瘤术后导致的大面积皮肤缺损的微循环进行概括，这可能需要研究细胞增殖，转移和化疗药物测试，相比于2D细胞能更有效地模仿体内反应。Eves等[22]体外培育角质形成细胞、成纤维细胞及黑素瘤细胞，经过3D生物打印生成黑色素瘤皮肤模型，体外研究细胞外基质及邻近皮肤细胞对皮肤黑素瘤细胞侵袭的影响。Harvey等[23]利用3D生物打印机打印出正常皮肤模型后，首先将其置于气液界面，7d后加入白细胞介素22（IL-22）共培养14d，即诱导出银屑病疾病模型，期间通过阿尔玛蓝染色观察细胞分化及代谢情况。

4 局限性与展望

3D生物打印皮肤仍存在较多缺陷，其韧性及机械性能同正常在体皮肤仍有较大差距，其不具有毛囊、血管、汗腺等皮肤附属器官，同时缺乏黑色素细胞、朗格罕氏细胞等成分[1]。 在这种新技术的临床潜力被实现前，血管化、最佳细胞、支架组合和3D生物打印的成本是亟需克服的困难[24]。

用生物兼容的“墨水”打印角质细胞、成纤维细胞和干细胞都是可能的，但是重新获得皮肤完整的结构和功能使得伤口修复控制温度觉以及感觉还有待实现。同时寻找低成本高性能的新型生物打印材料将是医学3D生物打印的发展方向之一。

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[收稿日期]2018-03-21 [修回日期]2018-05-30

編辑/李阳利