慢性心力衰竭患者血浆长链非编码核糖核酸XIST的表达及临床意义

韩虎魁，李刚，李其勇，陈勇，田文杰，李进嵩，黄浩，陶剑虹

方法：采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测我院收治的90例CHF患者（CHF组）及40例健康体检者（对照组）血浆LncRNA XIST的表达，分析血浆LncRNA XIST表达水平与B型利钠肽（BNP）、左心室射血分数等临床参数之间的相关性；用受试者工作特征曲线分析LncRNA XIST对CHF的预测作用；用Kaplan Meier生存分析LncRNA XIST对CHF患者1年生存率的影响；用多因素COX回归分析影响CHF患者预后的因素。

结果：与对照组比较，LncRNA XIST在CHF组患者中的表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。血浆LncRNA XIST的表达与BNP水平呈正相关（r=0.685，P=0.001），与左心室射血分数呈负相关（r=-0.618，P=0.002）。血浆LncRNA XIST诊断CHF的效率为0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。LncRNA XIST高表达患者的1年平均生存时间短于LncRNA XIST低表达者[（5.38±1.22）个月 vs（10.35±1.98）个月]，差异有统计学意义（χ2=37.98，P＜0.001）。多因素COX回归分析显示，LncRNA XIST高表达是CHF患者预后的独立影响因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

结论：血浆LncRNA XIST高表达与CHF有一定的相关性，高表达LncRNA XIST与CHF患者的预后较差有关。

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病的常见并发症，其发病率逐年上升，正日益威胁着人们的身体健康[1]。早期正确诊断和状态评价有助于采用合理治疗并降低心力衰竭（HF）患者的死亡率，但目前缺乏有效的早期诊断及预后评估生物标志物[2]。长链非编码核糖核酸（LncRNA）是一类内长度超过200 nt的功能性RNA，位于细胞核内或胞浆，在真核细胞内被普遍转录，但不具有或很少有蛋白编码功能[3]。近年来的研究表明，LncRNA参与人类许多疾病的发生、发展，如癌症、HELLP综合征和短指综合征。然而，LncRNA在HF患者中的研究报道较少[4-6]。前期通过基因芯片发现，LncRNA X染色体失活特异性转录本基因（X-inactive specific transcript，XIST）在CHF患者血浆中的表达明显高于正常对照组，提示LncRNA XIST可能参与和调节CHF的发生、发展。本研究旨在研究LncRNA XIST在CHF患者血浆中的表达及对预后的影响。

1 资料与方法

研究对象：入选2014-01至2017-01在我院心血管内科经临床确诊的CHF患者90例为CHF组。入选标准：（1）符合CHF诊断标准或有左心室扩大、左心室射血分数降低；（2）有明确导致HF的基础疾病；（3）年龄＞18岁，性别不限；（4）正规抗HF治疗不少于1个月。排除标准：（1）恶性肿瘤性疾病或严重感染性疾病、器官移植病史、急性失代偿性HF；（2）入选前1个月内发生急性冠状动脉事件（不稳定性心绞痛、急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死）；（3）血肌酐 ＞2.5 mg/ml；（4）已有文献报道的会对循环LncRNA XIST水平造成影响的情况。另选择健康对照受试者40例为对照组。对照组经详细问诊、查体及实验室检查，排除器质性心脏疾病及其他系统的急、慢性疾病和已知会对LncRNA XIST表达造成影响的疾病；心电图无异常，超声心动图排除心脏结构和心功能异常。所有研究者均签署知情同意书, 经我院伦理委员会批准。

一般实验室检查：两组受试者在入院时接受血浆B型利钠肽（BNP）以及肝、肾功能等相关指标检测。

血浆总RNA提取：两组受试者均采集清晨空腹肘静脉血5 ml，即刻用含抗凝剂的紫色采血管采集静脉血静置于4℃冷藏30 min后，室温下3000 rpm离心15 min，留取上层血浆，置于-80℃冰箱备用。将分离所得血浆，置于冰上融化；取250 μl血浆样品，加入750 μl Trizol（RNA抽提试剂），振荡器混匀，静置5 min；加入200 μl氯仿，振荡器混匀，静置10 min；室温下离心12 000 rpm、10 min，留取上清液并量取其体积，转移至另一个无 核糖核酸酶（Rnase）的EP管中；分别加入与上清液等体积的异丙醇，振荡器振荡混匀，室温下静置3 min；室温下离心12 000 rpm、10 min；倒出管内液体，加用1 ml 75%乙醇；室温12 000 rpm离心2 min；倒出乙醇，并用Tip枪头将剩余液体吸干净，晾干。每管中加入10 μl无Rnase的双蒸水（ddH2O），以能够充分溶解RNA；用分光光度计测定总RNA浓度及纯度。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析LNCRNA XIST的表达水平：提取血浆总RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μl体系中加2 μg总RNA进行互补脱氧核糖核酸（cDNA）的合成。qRT-PCR采用2x SYBR Green PCR Master Mix试剂，取适量cDNA作为摸板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μl体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行PCR扩增，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照。PCR反应在定量PCR反应仪上进行。三次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。

统计学方法：采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。血液标本中LncRNA XIST的表达差异采用t检验分析，用 ±s表示；血浆LncRNA XIST与BNP水平的相关性分析采用线性回归法；用受试者工作特征（ROC）曲线分析血浆LncRNA XIST表达水平对CHF的预测能力；用Kaplan-Meier法分析血浆LncRNA XIST表达水平与患者1年生存时间的关系；用多因素COX回归分析CHF患者预后的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组受试者的一般资料比较（表1）：CHF组90例患者平均年龄（60.35±13.39）岁，其中男性48例，女性42例；纽约心脏协会心功能分级Ⅰ级20例，Ⅱ级23例，Ⅲ级22例，Ⅳ级25例。对照组40例受试者平均年龄（58.95±7.65）岁，其中男性22例，女性18例。两组受试者在性别、年龄、身高、体重、血门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶水平、吸烟和高尿酸血症者比例等方面的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表1 两组受试者的一般资料比较

表1 两组受试者的一般资料比较

注：CHF：慢性心力衰竭；AST：门冬氨酸氨基转移酶；ALT：丙氨酸氨基转移酶

项目 CHF组(n=90) 对照组(n=40) P值性别(男/女，例) 48/42 22/18 0.860年龄(岁) 60.35±13.39 58.95±7.65 0.170身高(cm) 160.0±15.0 159.0±15.0 0.712体重(kg) 60.0±12.0 57.0±10.0 0.545吸烟[例(%)] 50(55.6) 29(72.5) 0.068 AST(mmol/L) 46.0±13.0 40.0±10.0 0.090 ALT(mmol/L) 49.8±11.0 45.5±13.4 0.099高尿酸血症[例(%)] 50(55.6) 26(65.0) 0.313

两组受试者血浆中LNCRNA XIST与BNP水平比较（图1）：与对照组比较，CHF组患者的血浆LncRNA XIST及BNP水平显著升高，差异均有统计学意义（t分别为12.69和14.63，P均＜0.001）。

图1 两组受试者血浆LncRNA XIST（1A）与B型利钠肽水平（1B）比较

CHF患者血浆LncRNA XIST与BNP水平的相关性分析（图2）：线性相关分析显示，CHF患者血浆LncRNA XIST与BNP水平呈正相关关系（r=0.685，P=0.001）， 与 LVEF呈 负 相 关 关 系（r=-0.618，P=0.002）。

图2 血浆LncRNA XIST与B型利钠肽水平（2A）及左心室射血分数（2B） 的关系

血浆LncRNA XIST水平预测CHF的ROC曲线分析结果（图3）：ROC曲线分析显示，作为预测CHF的生物标志物，血浆LncRNA XIST水平的曲线下面积（AUC）为 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）。

图3 血浆LncRNA XIST水平预测慢性心力衰竭的受试者工作特征曲线

Kaplan-Meier法分析血浆LncRNA XIST表达水平与CHF患者1年生存时间的关系（图4）：根据血浆LncRNA XIST平均表达水平，90例CHF患者中，44例LncRNA XIST高表达（≥8.939），其余46例LncRNA XIST低表达（＜8.939）。Kaplan-Meier分析显示，LncRNA XIST高表达患者的1年平均生存时间[（5.38±1.22）个月]短于低表达者[（10.35±1.98）个月]，差异有统计学意义（χ2=37.98，P＜0.001）。

图4 血浆LncRNA XIST表达水平与慢性心力衰竭患者1年生存时间的关系

多因素COX回归分析CHF患者预后的影响因素（表2）：分析结果显示，LncRNA XIST高表达是CHF患者预后的独立影响因素（HR=3.370，95%CI：1.730～6.550，P＜0.001）。

表2 多因素COX回归分析慢性心力衰竭患者预后的影响因素

3 讨论

HF是指心脏不能维持足够的心输出量以满足身体对代谢的需要和静脉血回流受阻的状态[7]，是许多心血管疾病终末期的表现。研究表明，人群中HF的患病率和发病率随着年龄增加而大幅度升高，50岁人群中HF的患病率为1%，80岁年龄段可升至10%，HF的年发病率在45～54岁人群中为0.2%，而在85～94岁年龄段则为4%[8,9]。我国2000年大样本调查结果表明，HF发病率为0.9%，随着年龄增高，HF的发病率显著上升[10,11]。HF患者预后差，死亡率高，其具体的发病机制及预后预测标志物尚未完全阐明[12,13]。

LncRNA是一类位于细胞核内或胞浆内长度超过200 nt的功能性RNA，在真核细胞内被普遍转录，但不具有或很少具有蛋白编码功能。近年来，LncRNA与复杂疾病发生之间的关系备受关注，人们对LncRNA在细胞生物学中的功能模式展开了一系列研究。最近研究表明，LncRNA的异常表达与心血管疾病的发生密切相关[14,15]。Wang等[16]的研究发现，抑制重组人抗增殖蛋白2（PHB2）的失活，可抑制心肌细胞凋亡。Wang等[17]为探讨心肌肥大细胞中微小RNA（miR）和LncRNA的作用，使用血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对体外培养的心肌细胞进行干预，发现心肌细胞中miR-489表达量明显减少。使用基因转染技术上调心肌细胞中miR-489的表达量可拮抗Ang Ⅱ导致的细胞肥大损伤；进一步探索其中的分子机制时发现，LncRNA CHRF可作为miR-489的“内源性海绵”，下调miR-489的表达水平，从而对miR-489的靶基因Myd88进行调控，影响心肌细胞肥大。Leung等[18]为研究AngⅡ对基因转录网络的影响，使用AngⅡ干预体外培养的血管平滑肌细胞，发现参与细胞增殖的miR-221和miR-222转录自LncRNA Ang362，敲除Ang362后miR-221和miR-222表达下降，血管平滑肌细胞增殖降低。

LncRNA XIST是哺乳动物体内X染色体失活的主要调节基因，并且XIST基因只能从失活的X染色体中转录而来[19]。多项研究证实，XIST在人类细胞分化、增殖和基因组功能与形态的维护方面发挥重要作用[20-22]。但目前国内外尚未见LncRNA XIST在心血管疾病中的作用及机制的相关报道。本研究发现，与健康对照者比较，LncRNA XIST在CHF患者中的表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；血浆LncRNA XIST的表达与BNP水平呈正相关（r=0.685，P=0.001），与左心室射血分数呈负相关（r=-0.618，P=0.002）；血浆LncRNA XIST水平预测 CHF 的效率为 0.854（95%CI：0.795～0.932，P＜0.001）；高表达LncRNA XIST患者的1年平均生存时间明显短于LncRNA XIST低表达者（P＜0.05）。

总之，本研究提示，血浆LncRNA XIST高表达与CHF有一定的相关性，高表达LncRNA XIST与CHF患者的预后差相关。