彩色马蹄莲栽培品种对软腐病的抗性鉴定

王雪皎　郭彦斌　李紫薇　郑冉冉　吴红芝

摘 要 为筛选抗软腐病品种，调整云南彩色马蹄莲品种结构，对云南不同地区收集到的4个软腐病病原菌进行致病力测定，筛选出强致病力菌株p3，并通过形态学和16S rDNA分子鉴定为胡萝卜果胶软腐杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）。将p3菌株接种于具4～5叶片的不同品种彩色马蹄莲上，记录病情指数。结果表明：测试的彩色马蹄莲品种均为感病品种，但不同品种间抗性存在差异，其中栽培品种ym063、ym044、ym068的抗性较好，其次为ym048，ym008、ym011。

关键词 彩色马蹄莲 ；细菌性软腐病 ；病原鉴定 ；抗性鉴定

中图分类号 S436.8 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.06.015

Resistance Identification of Zantedeschia hybrida Cultivars Against the Soft Rot

WANG Xuejiao GUO Yanbing LI Ziwei ZHENG Ranran WU Hongzhi

（Yunnan Agriculture University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract In order to screen the resistant cultivars to soft rot and adjust the variety structure of Zantedeschia hybrida Spr. in Yunnan， four strains of soft rot bacteria were collected in different areas of Yunnan， and their pathogenicity determined. One strain p3 out of the four was screened to have a high pathogenicity and identified as Pectobacter carotovora subsp. carotovora Pcca through morphological observation and 16 SrDNA molecular identification. The strain p3 was then inoculated onto different cultivars of Zantedeschia hybrida Spr. having 3～4 leaves， and the disease index was recorded. The results showed that all the cultivars tested were susceptible to the bacterial soft rot but were different in resistance against the bacterial soft rot among different cultivars， of which cultivars YM063， YM044 and YM068 showed higher resistance to soft rot， followed by cultivars YM048， YM008 and YM011.

Keywords Zantedeschia hybrida ； bacterial soft rot ； pathogen identification ； resistant identification

彩色馬蹄莲（Zantedeschia hybrida Spr.）又称彩色海芋。原产于南非，为天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本球根花卉[1-2]。彩色马蹄莲具有形态高雅、色彩艳丽、花叶俱赏等特征，应用范围非常广泛。除可作优良切花、盆花外，还是花束、花篮、花坛、花境等的重要花材。自20世纪90年代来，受到国内外消费者的大力追捧，已成为世界性新兴高档花卉。然而因软腐病，彩色马蹄莲的发展却受到了极大的限制[3-4]。据报道，彩色马蹄莲软腐病的致病病原菌为果胶软腐杆菌（Pectobacterium carotovorum carotovorum，PCC）。该病菌广泛分布于温带和热带地区，寄主范围广泛，大多寄生在植物的细胞腔、气孔、伤口处，少数寄生在微管组织中，常使被侵染器官薄壁组织发生浸渍腐烂，最终导致整个植株死亡。Pcc可以潜伏侵染，一旦遇高温、高湿、伤口、土壤通气不良等适宜条件，极易引发病害。虽已有了不少生物、化学等方法防治彩色马蹄莲细菌性软腐病，但防治效果均不理想。目前，应用最多的主要是靠严格的卫生管理或使用灭菌泥炭等消毒基质[5-10]。

关于彩色马蹄莲软腐病的研究大多集中在病原菌的分离与鉴定[11]、生物学特性、病害的症状识别与综合防治方面[12-13]，品种抗性方面研究尚少。云南独特的地理环境和较大的日温差，有利于促进植物养份的积累，为彩色马蹄莲等球根花卉种球生产提供了得天独厚的自然条件，是我国重要的彩色马蹄莲产业基地[14]。品种结构合理布局是云南彩色马蹄莲产业持续发展和花农获得经济效益的保证，然而尚未见云南栽培品种抗性鉴定和使用抗病品种控制病害的研究报道。本研究对云南不同地区病株进行了病原菌的分离、分子鉴定、致病性鉴定、及不同品种彩色马蹄莲的抗性鉴定，旨在为今后栽培管理提供理论和实际参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

所用供试品种组培苗ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048，由云南农业大学实验组收集保存的种球采用组织培养的方法统一建立无菌体系获得。

分别从热区（玉溪杨武）、温带（昆明大板桥）、寒凉区（寻甸）等不同气候型区域采集彩色马蹄莲软腐病植株，作为病原菌分离鉴定的来源材料。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

采用稀释涂布平板法和平板划线分离法，分别切取彩色马蹄莲植株茎或叶病健交界处组织，切成小块，用75%的酒精表面消毒30 s，无菌水洗3次，5% NaCl表面消毒1 min，无菌水洗3次，研磨碎，加入少量无菌水，振荡静置5 min后将病健组织研磨液等梯度稀释至10-6，用稀释涂布平板法将不同稀释度溶液涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基，放置28℃培养箱中，24 h后观察菌落形态。挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上划线，纯化培养24 h，纯化3次后于-80℃保存菌株。

1.2.2 最适培养基的筛选

将菌株活化后用无菌水等梯度稀释至10-6，取10-4，10-5，10-6三个稀释度的菌悬液各200 μL，分别涂布于TSA、PDA、LB、牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每浓度3个平板，放置20～30 min后，再将平板倒置于28℃恒温培养箱培养48 h，观察病原菌在不同稀释度、不同培养基条件下菌落数量分布，根据平板上菌落的稳定性和数量确定适宜的培养基种类。选取适宜稀释度培养基（每皿30～300个菌落）计数菌落。

1.2.3 菌株的鉴定

采用简单染色法、Gram染色法在油镜下观察菌体形态，对形态上初步判断为Pcc的病原菌，采用PCR进行进一步鉴定。

采用DNA提取试剂盒（Promega）提取细菌基因组DNA，用细菌16S通用引物PF：5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′和PR：5′-CAAGGCATCCACCGT-3′进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP1 μL、5U/μL TaqDNA酶0.2 μL、5 mmol/L正反向引物各1 μL、DNA模板1 μL，双蒸水补足至25 μL。PCR扩增程序为：94℃ 2 min；94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物纯化后，由昆明硕擎生物科技有限公司双向测序，引物分别为PF和PR，将测得的基因序列与GenBank数据库的序列进行同源性分析。

1.2.4 回接试验

选取相同或相近继代培养代数的彩色马蹄莲的组织培养苗进行移栽，当组培苗移栽成活具4～5葉片时，将菌株接种于彩色马蹄莲上。保存的菌种在牛肉膏蛋白胨培养基中活化，28℃培养24 h，用无菌水配成浓度为1×108 CFU/ml（colony-forming unitsperml，每毫升繁殖的病菌数）的菌悬液。采用直接叶片喷菌液、针刺侵染菌液和注射器注射菌液3种方法接种具4～5叶的彩色马蹄莲幼苗，分别是将菌悬液直接喷洒在幼苗植株表面；用无菌牙签蘸取细菌悬浮液针刺接种健康彩色马蹄莲叶片的叶片中部，喷水保湿，以灭菌水作为对照；将菌悬液用100 μL的医用注射器注射到彩色马蹄莲叶片中部，每个处理注射10 μL，重复3次并用无菌水做对照，每12 h观察发病情况。

1.2.5 马蹄莲品种的抗性鉴定

选取彩色马蹄莲品种ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048相同或相近继代培养组织培养苗，移栽在装有相同配比基质的独立花盆中，置在大棚中生长，具4～5个叶片时进行接种。

取致病性强的p3菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养24 h进行活化，用无菌水配成3个浓度1×108 CFU/mL，1×107 CFU/mL，1×106 CFU/mL的菌悬液。分别用注射器注射不同浓度菌悬液于具4～5叶期的叶片上，每处理重复6次，以无菌水做对照，观察发病情况。

叶片发病症状分级：0级，叶片无病状：1级，0<病斑面积≤10%总面积；2级，10%<病斑面积≤30%总面积；3级，30%<病斑面积≤50%总面积；4级，50%<病斑面积≤70%总面积；5级，70%<病斑面积≤100%总面积（总面积按直径1.5 cm的圆面积计算）。

病情指数：高抗（HR）：0≤DI<25；抗（R）：25≤DI<45；中抗（MR）：45≤DI<65；感（S）：65≤DI<85；高感（HS）：85≤DI。

病情指数=100×∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总叶数×最高级代表值）

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与分离菌株的鉴定

从杨武、大板桥、寻甸等不同区域采集的彩色马蹄莲病株上分离得到4个软腐病菌株（图1），分别命名为p1、p2、p3、p4，4株菌株均能引起发病。直接叶片喷菌液不能使彩色马蹄莲叶片发病，针刺侵染菌液和注射器注射菌均可以引起发病。叶片发病时，出现水浸状病斑，随着病情加重病斑向四周扩散，最终导致叶片腐烂，植株倒伏，该病菌接种症状与田间症状一致（图2）。其中菌株p3致病性最强。

2.2 最适培养基的筛选

4种培养基配方中，用PDA和牛肉膏蛋白胨培养基分离出的细菌数量平均都在100以上。PDA培养基分离到的菌落数量的最小值和最大值相差很大，牛肉膏蛋白胨培养基菌落数量较为稳定。LB培养基分离到的细菌数量相对稳定，但没有牛肉膏蛋白胨的数量多，TSA培养基每皿只分离到37个细菌，数量最少。综合考虑，牛肉膏蛋白胨培养基分离到的细菌数量和稳定性是最优的（表1）。

2.3 分离菌株的鉴定

分离到的菌落前期在牛肉膏蛋白胨固体培养基上为透明，灰白色，表面湿润平滑微微隆起，后期为半透明，圆形。挑取纯化的单个菌落，经草酸铵结晶紫染色后，在油镜下观察，呈现紫色，菌体为短小杆状（图3）。革兰氏染色反应试验显示为革兰氏阴性（图4）。

以菌株p3基因组DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增，获得1条1.5 kb左右的特异性片段（图5）。将PCR产物测序结果与GenBank数据库中序列进行BLAST比对分析。结果表明，该序列与胡萝卜果胶软腐杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum）相似性最高，达到99%。

2.4 不同彩色马蹄莲品种对p3菌株抗病性评价

用致病性强的p3接种测试品种，观察24～72 h病菌侵染测试品種后的病情指数（表2）。结果表明，所有测试品种均为感病品种，同一品种随接种菌液浓度增加发病程度逐渐加重，不同品种对软腐病抗病性由强到弱的排序为：ym068、ym044、ym063、ym048、ym008、ym011。

3 结论与讨论

软腐病是影响彩色马蹄莲产业的重要病害。目前，该病的防治主要是靠严格的卫生管理和使用灭菌泥炭等消毒基质。但这些防治方法增加生产成本，提高投资门槛，极大地限制了彩色马蹄莲的发展。因此，筛选抗病种质资源，选育抗病品种是控制彩色马蹄莲软腐病的最佳途径。本研究通过云南不同地区采集的彩色马蹄莲细菌性软腐病病株分离得到病原菌，先进行菌株致病性研究，筛选出强致病力菌株p3，避免由于菌株致病性过弱导致的抗性评价的偏差。经过回接试验，该菌使得ym039再次感病。革兰氏染色试验确定该菌种为革兰氏阴性接菌，16SrDNA分子鉴定显示该菌与Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum相似度99%，确定该菌为胡萝卜果胶软腐杆菌。常用的细菌接种鉴定方法是针刺法和喷雾法。简单喷雾法有时不利于接种，而针刺法可以给彩色马蹄莲幼苗叶片造成伤口，有利于病原菌对彩色马蹄莲的侵染，但抗病性是通过产生病斑大小进行鉴定，针刺法难以控制侵染的初始菌量[15]。本试验用注射法即可以创造感染伤口又可以精确控制剂量。所以，本研究抗性鉴定采用10 μL注射法，将病原菌接种在ym008，ym011，ym044，ym063，ym068，ym048六个彩色马蹄莲品种，获得中抗病品种ym068、ym044、ym063，为生产上推广栽培应用提供依据。

彩色马蹄莲的叶片、叶柄和种球等组织，常作为抗性能力筛选的活体材料，但仍然存在一些弊端[16]。一是容易造成资源浪费，提高鉴定成本；二是鉴定结果可能有误差。室内离体叶盘接种鉴定可以人为控制生长环境、菌液浓度和剂量，但鉴定结果不能完全体现出田间的抗病能力。因此，本实验将相同或相近继代培养代数的组培苗移栽至含有灭菌基质的花盆中，在田间进行同质化管理，并采用定量注射法（浓度相同、计量相同），从而达到快速准确鉴定马蹄莲抗病性的目的。

软腐病是关系到彩色马蹄莲产业兴衰的重要病害，利用现代分子技术如基因工程等对品种抗性差异作更深入的研究，培育彩色马蹄莲抗性品种，也可真正促进彩色马蹄莲产业的发展[17]。

参考文献

[1] Singh Y， Wyk A E V， Baijnath H. Taxonomic notes on the genus Zantedeschia， Spreng. （Araceae） in southern Africa[J]. South African Journal of Botany，1996，62（6）：321-324.

[2] 贺水莲，吴景芝，陆 燕，等. 四倍体彩色马蹄莲的生长及对低温胁迫的生理响应[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版），2017，43（5）：570-578.

[3] Wright P J， Burge G K， Triggs C M. Effects of cessation of irrigation and time of lifting of tubers on bacterial soft rot of calla （Zantedeschia spp.） tubers[J]. New Zealand Journal of Experimental Agriculture，2002，30（4）：265-272.

[4] Kuehny J S. Calla history and culture. Hort Technolgy， 2000， 10（2）： 267-274.

[5] 仇 硕，李秀娟，张翠萍，等. 三种杀菌剂诱导彩色马蹄莲抗细菌性软腐病的研究[J]. 北方园艺，2012（3）：140-142.

[6] 仇 硕，张翠萍，李秀娟，等. 几种植物生长调节物质诱导彩色马蹄莲抗细菌性软腐病初探[J]. 江苏农业科学，2012，40（6）：106-109.

[7] Wright P J， Triggs C M， Burge G K. Control of bacterial soft rot of calla （Zantedeschia spp.） by pathogen exclusion， elimination and removal[J]. New Zealand Journal of Experimental Agriculture， 2005， 33（2）：117-123.

[8] 赵延昌，孙福在. 马蹄莲细菌性软腐病及其防治[J]. 植物检疫，2000，26（1）：46-47.

[9] Cho H R， Joung H Y， Lim K B， et al. Effect of calcium and silicate application on pathogenicity of Erwinia carotovora， subsp. carotovora， in Zantedeschia spp[J]. Horticulture Environment & Biotechnology，2013， 54（4）： 364-371.

[10] Tal L K， Zohar K， Alexander L， et al. A systemic response of geophytes is demonstrated by patterns of protein expression and the accumulation of signal molecules in Zantedeschia aethiopica[J]. Plant Physiol Biochem， 2013， 71（10）： 218-225.

[11] 厉 艳，魏晓棠，甘琴华，等. 入境马蹄莲细菌性软腐病菌的分离鉴定[J]. 食品安全质量检测学报，2014（12）：3 944-3 946.

[12] 王 森，李依娜. 花卉细菌性软腐病的症状识别与综合防治[J]. 花木盆景：花卉园艺，2003（11）：30-31.

[13] 赵廷昌，孙福在，阎克峰. 马蹄莲细菌性软腐病及其防治[J]. 植物保护，2000，26（1）：46-47.

[14] 赵培飞，吴丽芳，郑 凌，等. 云南彩色马蹄莲的生产与发展前景[J]. 湖南农业科学， 2002（3）：69-70.

[15] 商 雨，吴景芝，贺水莲，等. 马蹄莲软腐病自然抗性机制研究[J]. 南方农业学报，2015，46（12）：2 129-2 134.

[16] 张 慧，于仁敬，邹佳男，等. 大豆细菌性病害病原菌分离鉴定与致病性评价[J]. 大豆科学，2016，35（1）：112-116.

[17] 桂腾茸，姬 盼，孔宝华，等. 云南几个苹果新品种对腐烂病的抗性鉴定[J]. 华北农学报，2014，29（s1）：57-61.