限制性酶解—钙融合制备高钙豆粉的工艺研究

寻崇荣，范志军，王冬梅，王中江，江连洲，李 杨

(1东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司，哈尔滨 150036)

豆乳粉中含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸等营养物质及大豆低聚糖、大豆异黄酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人体消化吸收，深受消费者的喜爱。目前，制备豆乳粉最常用的是传统湿法工艺[1]。但传统工艺技术制得的豆乳粉含钙量较低，钙离子的吸收利用低，不利于豆乳粉在国内外的市场推广[2]。

研究表明，酶解大豆蛋白可提高与钙离子的结合能力，小分子肽、氨基酸等与钙鳌合，形成可溶性鳌合物，阻止小肠内钙的沉淀，以促进钙的吸收利用[3]。大豆蛋白水解物对碳酸钙晶体生长有抑制作用，其抑制作用与大豆肽结构有关，且大豆肽分布到碳酸钙粒子表面会使粒子通过亲水作用均匀分散在溶液中提高钙分散性[3-4]。许慧等[5]利用碱性蛋白酶水解大豆蛋白改善对磷酸钙的融合性，但需对蛋白水解物进行脱苦处理。包小兰等[6]对大豆蛋白酶解物进行脱酰胺化处理，结果发现，脱酰胺化作用可增加大豆蛋白水解物的钙融合量，抑制胃蛋白酶消化作用。张美玲等[7]对大豆分离蛋白的碱性蛋白酶酶解产物进行类蛋白反应修饰，结果发现，大豆分离蛋白酶解联合类蛋白反应修饰可提高钙离子螯合能力，但会影响多肽的功能性及口感风味。周小玲[8]对比研究了不同钙盐对大豆蛋白聚集的影响，结果发现，离子形式的CaCl2和CaSO4会增大蛋白溶液浊度，而分子形式的Ca3(PO4)2和CaCO3则对大豆蛋白聚集的影响较弱。目前，植物蛋白水解后会产生苦味肽[9]，葛文静等[10]研究表明，利用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白可得到粘度较低、苦味较弱的多肽。风味蛋白酶可有效水解苦味肽，但对完整大豆蛋白的酶解效果较弱，因此可联合木瓜蛋白酶使用，且木瓜蛋白酶与风味蛋白酶酶解最优参数相似，因此本研究采用木瓜蛋白酶与风味蛋白酶联合酶解，以降低豆粉苦味[11]。

目前，已有酶解法提高豆乳粉溶解性的研究，然而采用限制性酶解—钙融合制备高溶解性高钙豆粉的研究尚未见报道。本文以传统湿法加工技术制备豆乳粉为基础，利用限制性酶解及钙融合技术改善高钙豆粉的溶解性及钙吸收效率，为高钙豆粉的生产加工提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆，哈尔滨九三油脂集团；大豆磷脂，周口慧洋饲料有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力800 U/mg)、风味蛋白酶(20 U/mg)，丹麦novo公司；食品级碳酸钙，上海圣昆化工有限公司；实验所需基础试剂均为分析纯，北京化学试剂公司。

1.2 仪器

FDM-Z80豆浆机，上海伟业仪器厂；Ultra-Turrax T25高速分散器，德国IKA公司；喷雾干燥机，无锡昂益达机；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；pHS-25型酸度计，上海江仪仪器有限公司；电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂；XW-80A旋涡混合器，上海青浦沪西仪器厂；HYP-Ⅱ八孔消化炉，上海纤检仪器有限公司；LNK-871型凯氏定氮快速自动蒸馏器，江苏省宜兴市科教仪器研究所。

1.3 豆乳粉的制备

大豆→浸泡→热烫→磨浆→浆渣混合物→浆渣分离→豆乳→酶解→灭酶→钙融合→均质→调配→浓缩→喷雾干燥→豆乳粉。

参照齐宝坤等[1]的方法称取50 g大豆于烧杯中，用浓度为0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水热烫5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH为6.5～7.0的90℃弱碱水进行磨浆得浆渣混合物，然后浆渣分离得豆乳，调节豆乳温度55℃和pH 7.0，加入一定量木瓜蛋白酶与风味蛋白酶进行酶解，酶解后95℃灭酶5 min，向酶解后的豆乳中加入0.6%的食用级碳酸钙(占豆乳固形物含量的百分比)，一定压力下均质处理，添加1.5%的大豆磷脂进行调配混匀，将调配好的豆乳进行真空浓缩至豆乳固形物含量达15%左右，然后在进口温度为180℃、出口温度为80℃条件下进行喷雾干燥即得高钙豆乳粉。

1.4 限制性酶解工艺的单因素确定试验

保持均质压力为25 MPa、均质时间为8 min，在其他条件不变的情况下，分别选取酶解时间为0.5、1、1.5、2、2.5h，酶添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(豆乳质量的百分比)，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量添加比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5进行单因素试验。确定酶解工艺对蛋白质分散指数(%)和可溶性钙结合量(mg/g)的影响。

1.5 钙融合工艺的单因素确定试验

保持酶解时间为1.5 h、酶添加量为1.5%、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量添加比为1∶4，在其他条件不变的情况下，选取均质压力为10、15、20、25、30 MPa，均质时间为2、5、8、11、14 min进行单因素试验。确定钙融合工艺对蛋白质分散指数(%)和可溶性钙结合量(mg/g)的影响。

1.6 固形物含量的测定

豆乳中固形物含量按照商业标准SB/T 10633-2011进行测定。

1.7 蛋白质分散指数的测定

参照齐宝坤等[1]的方法取一定量豆乳粉样品以1∶20的料液比分散于去离子水中，充分搅拌30 min，待分层后将溶解液于3 000 r/min下离心10 min，离心后取上清液测定蛋白含量(凯氏定氮法)。蛋白质分散指数的计算公式如式(1)：

(1)

1.8 可溶性钙结合量的测定

参照包小兰[6]的方法，称取0.01 g豆粉样品溶于3 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.4)，离心0.5h(6 000 r/min离心)，收集上清液至透析袋(MWCO∶500 Da)中，然后将透析袋移到Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中，用保鲜膜密封，用磁力搅拌器在冰箱中(4℃)流动透析，透析结束后，将透析液移到25 mL容量瓶中并定容，通过空气—乙炔火焰原子吸收光谱法测定钙含量(参数与包小兰[6]的设置一致)，即为可溶性结合钙质量，计算公式如式(2)：

(2)

1.9 数据处理

每组试验都进行3次平行试验，并将试验数据进行误差分析。采用统计学软件SPSS 18对试验数据进行方差分析、相关性和差异显著性分析；采用Origin 8.5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 酶解工艺对豆粉蛋白质分散指数和可溶性钙结含量的影响

2.1.1复合酶质量添加比对蛋白质分散指数和可溶性钙结合量的影响 蛋白质分散指数可表征豆粉的溶解性，其值越高，豆粉的溶解性越好[1]；可溶性钙结合量可表征豆粉中钙离子的人体吸收效率，其值越高，人体对钙离子的吸收效果越好[12，19]。由图1可知，酶解可显著提高豆粉的蛋白质分散指数及可溶性钙结合量[14-15]，但木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量添加比对蛋白质分散指数的影响不显著(P>0.05)，这两种酶的质量添加比从1∶1增加到1∶2时，可溶性钙结合量随这两种酶质量添加比的增加而显著提高(P<0.05)，而继续增加这两种酶的质量添加比，钙结合量变化不显著(P>0.05)，且比值超过1∶3时，钙结合量有下降趋势。推测木瓜蛋白酶对豆粉蛋白质分散指数及可溶性钙结合量的效果高于风味蛋白酶，但风味蛋白酶对钙结合量有一定促进作用。原因可能是木瓜蛋白酶对豆粉蛋白的酶解较充分，产生大量多肽，风味蛋白酶继续酶解产生的多肽，形成更多的小分子肽，促进与钙离子的结合，增加了钙结合量[6，13]，但风味蛋白酶相对添加过多，导致部分多肽进一步水解成分子量小于8 KDa的小分子肽，减少多肽与钙离子的结合位点，导致豆粉的钙结合量降低[13，18]。

图1 复合酶质量添加比对蛋白质分散 指数和可溶性钙结合量的影响

2.1.2酶解时间对蛋白质分散指数及可溶性钙结合量的影响 由图2可知，当酶解时间从0.5 h增加到1.5 h时，豆粉蛋白质分散指数和钙结合量随酶解时间的延长而显著增加(P<0.05)，酶解时间超过1.5 h后，蛋白质分散指数及钙结合量有下降趋势，但两者变化均不显著(P>0.05)，说明适当增加酶解时间可改善豆粉的溶解性及钙结合量[18]。原因可能是酶解初期，底物相对含量较高，酶促反应效率较快，豆乳中大分子蛋白逐渐降解为小分子肽，蛋白乳化性增加，继而增加与钙离子的结合量[18]及蛋白质分散指数[16]；但随着酶解时间的继续延长，风味蛋白酶不断降解大豆蛋白肽为小分子肽及氨基酸，导致小分子肽增多，不易吸附于油水界面，多肽乳化性降低，继而降低豆粉的蛋白质分散指数，且多肽分子量过小会减少钙离子结合位点，导致钙结合量有降低趋势[18]。这与Bao等[18]的研究结果一致，即部分水解可使大豆球蛋白的紧密结构松弛，增加钙结合位点，但过度水解会降低结合位点，降低钙结合能力。

图2 酶解时间对蛋白质分散指数及 可溶性钙结合量的影响

2.1.3酶添加量对蛋白质分散指数及可溶性钙结合量的影响 由图3可知，当酶添加量从0.5%升高到1.5%时，豆粉蛋白质分散指数和可溶性钙结合量随着酶添加量的增加而显著增加，当加酶量达到1.5%后，继续增加酶添加量，蛋白质分散指数和钙结合量变化不显著，说明适当增加酶添加量可提高豆粉的溶解性及钙结合量。原因可能是相对底物含量的限制及酶分子之间相互碰撞减少了底物与酶碰撞机会，降低酶促效应效率，抑制蛋白质分散指数和钙结合量的增加，这与徐锦丽[17]及包小兰[6]的研究结果一致，即适度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及可溶性钙结合量。

图3 酶添加量对蛋白质分散指数 及可溶性钙结合量的影响

2.2 钙融合工艺对豆粉蛋白质分散指数和可溶性钙结含量的影响

图4 均质压力对蛋白质分散指数及 可溶性钙结合量的影响

2.2.1均质压力对蛋白质分散指数和可溶性钙结合量的影响 由图4可知，豆粉蛋白质分散指数随着均质压力的增加而显著增加(P<0.05)；当均质压力从10 MPa升高到25 MPa时，可溶性钙结合量随均质压力的增加而显著增加(P<0.05)，均质压力达到25 MPa后，继续增加压力，豆粉中钙结合量无显著变化(P>0.05)，说明提高均质压力，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高钙结合量。原因可能是在的高速分散作用下大豆多肽与大豆磷脂及钙离子充分接触，促进多肽与磷脂及多肽与钙离子的相互作用，提高多肽的乳化性及钙融合性，且将豆乳分散为更小的乳液滴，以致豆粉蛋白质分散指数及钙结合量提高[14]。压力增大，可提高分散效果[14]，在均质压力大于25 MPa时，继续增加压力钙结合量变化不明显，原因可能是达到钙结合位点上限。综合考虑加工成本，选择均质压力为25 MPa。

2.2.2均质时间对蛋白质分散指数和可溶性钙结合量的影响 由图5可知，均质初期，随着均质时间的延长，豆粉蛋白质分散指数及钙结合量显著增加(P<0.05)，均质时间超过8 min后，豆粉蛋白分散指数无显著变化，11 min后，钙结合量变化不大。说明适当增加均质时间可改善豆粉的溶解性与钙结合量。综合考虑蛋白质分散指数、钙结合量的变化及加工成本，选择均质时间为8 min。

图5 均质次数对蛋白质分散指数和豆乳表观粘度的影响

3 结论

本文对限制性酶解—钙融合制备高钙豆粉工艺进行研究，分别采用离心法及原子吸收光谱法测定豆粉的蛋白质分散指数和可溶性钙结合量。单因素试验表明，酶解时间、酶添加量、均质压力、均质时间对豆粉蛋白质分散指数及可溶性钙结合量具有显著影响。酶解可显著提高豆粉的蛋白质分散指数及可溶性钙结合量，但木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量添加比对蛋白质分散指数的影响不显著；适当增加酶解时间、酶添加量，适当提高均质压力及均质时间，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高钙结合量。◇