二氢杨梅素对神经退行性果蝇的作用❋

应曜宇 宋远见 胡昕迪 明 福 沈 玉 王玉兰

(徐州医科大学公共卫生学院, 徐州 221004)

大脑由神经元组成,而脑细胞一般是不可再生的,神经系统退行性疾病(neurodegenerative diseases)随着时间的推移而恶化。而目前仅有少数药物可以应用于此类疾病[1]。淫羊藿素、玉郎伞黄铜等一些化学物质对神经的保护作用和其作用机制进行了研究[2]。同样,笔者将通过二氢杨梅素(dihydromyricetin, DMY)是否能够防止脑神经退化的研究,进一步为治疗ND的新药物提供依据[3]。近年来,果蝇作为模式生物的优势越来越明显,除了体积小、繁殖强、价格低廉外,果蝇的神经退行性疾病的表型与人类退行性疾病也有很多的相似之处,果蝇的寿命和爬行能力是显示果蝇生存状态的直观指标,由于神经退化会使果蝇运动行为降低,寿命降低,这种直观现象可以成为实验成功与否的依据[4-5]。并且寿命和爬行能力检测方法简单,易操作,因此构建此模型可以为人类ND提供新的方法和药物选择。本实验采用玉米培养基培养普通果蝇为实验动物,设立正常组、ND模型组、加药组,进行分析比较。以期初步探索DMY在神经退行性疾病中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

江苏师范大学提供的正常黑腹果蝇180只,分为6组,包括正常对照组、ND(Al3+组)、ND+DMY(1mmol/L)、ND+DMY(5mmol/L)、ND+DMY(10mmol/L)、ND+DMY(15mmol/L)。培养正常果蝇若干代后,同时分别在各个培养基中加入对应材料,收集此代的子代雄果蝇并移入新加药培养基中用做实验。

1.2 培养基制作

普通玉米培养基(玉米粉8.25g,糖6.2g,水80ml,琼脂0.62g)加热搅拌均匀后加0.5ml丙酸倒入高压蒸汽灭菌后的培养瓶中,每瓶加入0.7g酵母粉。无菌环境静止2h后塞上棉塞,贴上标签分组。

1.3 试剂和仪器

硫酸铝,二氢杨梅素,玉米粉,红糖,琼脂,丙酸,酵母,去离子水,无水乙醚,低温冰箱,果蝇培养箱,高压灭菌锅,恒温水浴箱,电子分析天平,果蝇爬行管。

1.4 ND果蝇模型检测

通过果蝇爬行和寿命等行为学的改变来确定模型的成功[4,6]。

1.5 寿命计时

为了研究DMY是否会对神经退行性疾病及果蝇的寿命产生影响,收集子代果蝇,每 3d更换新鲜培养基,并记录果蝇存活数量,进行寿命分析。从收集子代果蝇为第1天开始计时,每天观察存活数量并进行记录。

1.6 爬行计数

将年龄为3d的待实验的果蝇麻醉后放入长度为25cm的爬行管,静止到果蝇苏醒后2h,将所有管壁上的果蝇微微震荡至管底,所有果蝇同时开始上爬,15s后记录每一区间内果蝇的数量。爬行结果评价： 从上至下每隔5cm视为1个区间,分别为高(high)(20～25cm),偏高(slightly higher)(15～20cm),中等(mid)(10～15cm),偏低(slightly lower)(5～10cm),低(low)(0～5cm)。如正好处于交界线上按高处计算。同样方法当天进行3次，取平均值,每次间隔不少于2h。第7天、第11天采用相同方法进行实验。

1.7 统计学处理

使用单因素方差分析比较各组果蝇寿命时间的差异,期间的关联强度采用Dunnett分析,使用χ2检验检测爬行实验数据;使用R×Cχ2检验分析各组之间分布差异。

2 结果

2.1 寿命计时

寿命实验果蝇初始样本量分别为28、29、25、26、27、26只。与正常对照组比较,模型组平均寿命均显著降低(P<0.01),药物干预组果蝇平均寿命也降低(P<0.01);模型组与模型药物干预组比较,ND+DMY(1mmol/L)、ND+DMY(5mmol/L)果蝇寿命明显提高(P<0.05),ND+DMY(10mmol/L)、ND+DMY(15mmol/L)果蝇寿命无明显变化。结果说明低浓度DMY对ND所造成的寿命降低具有一定的保护作用,浓度过高时则失去效果(表1)。

表1 各组果蝇寿命的比较

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsND group

2.2 爬行计数

爬行实验第3天样本量分别为45、39、39、45、24、12只。爬行实验第7天样本量分别为45、30、33、39、18、12只。爬行实验第11天样本量分别为39、15、24、27、9、0只。结果显示,随着年龄的增长,正常对照组变化很小,ND组和高浓度DMY+ND组表现出明显的攀爬能力减退。低浓度DMY+ND 组果蝇3、7、11d,其爬行能力较正常组无明显变化。ND组与正常对照组果蝇3、7、11d爬行能力表现出明显的降低,差异有统计学意义(P<0.01),表明经诱导后的ND果蝇其攀爬能力降低,符合行为能力减退这一行为学特征。低浓度DMY干预后的果蝇在3、7、11d均对攀爬能力有一定的改善作用,差异具有统计学意义(P<0.01)。同时随着年龄的不断增大,差异越来越明显(第11天ND+DMY(15mmol/L)组果蝇死亡计数为0)。综上,低浓度的DMY对ND运动能力降低具有一定的抑制作用(图1、表2)。

图1 第7天爬行实验结果

GroupHighSlightly higherMidSlightly lowerLow3d Normal441000 ND186537 ND+DMY (1mmol/L)*#353100 ND+DMY (5mmol/L)**##432000 ND+DMY (10mmol/L)170223 ND+DMY (15mmol/L)540217d Normal393210 ND1115310 ND+DMY (1mmol/L)*#281004 ND+DMY (5mmol/L)**##363000 ND+DMY (10mmol/L)80028 ND+DMY (15mmol/L)0162311d Normal324011 ND71304 ND+DMY (1mmol/L)*#161700 ND+DMY (5mmol/L)**##233010 ND+DMY (10mmol/L)30420 ND+DMY (15mmol/L)00000

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsND group

测量结果显示每天正常对照组爬行能力较强者最多,其次为低浓度加药组,高浓度加药组爬行能力急剧降低。

3 讨论

以铝离子诱导神经退行性疾病果蝇实验在国内外已有了很多论证,同时发现了很多对ND具有治疗作用的药物[7]。铝离子对于人类和大多数动物是一种神经毒剂。病理学上的统计结果表明,有个别的ND或者其他神经退行性疾病的病理有可能是由于铝离子的积累造成的。研究显示,2名患有ND的死者脑内,尤其是病变部位铝离子含量异常高。当Al3+被注入实验动物脑后,也发生了类似的变化。这表明铝离子对神经系统的危害很大。本实验直接通过铝离子混于食物中喂养果蝇,研究在铝离子作用下产生的神经退行性疾病的类似症状。

本研究应用果蝇作为工具,研究了金属离子铝与果蝇神经退行性疾病的关系。用铝离子喂食果蝇,能够使果蝇的寿命明显缩短[8],寿命的缩短是果蝇神经退行性疾病的重要特征。本研究结果表明,在金属离子铝的影响下,果蝇的运动能力随果蝇年龄的增大而显著降低。据此,笔者认为,铝离子确实能够诱使果蝇发生神经退行性疾病。与此同时,DMY对于果蝇的保护作用在此也可以得到体现。随着DMY浓度的增大,其保护作用会不断增强,但超过一定浓度时,其保护作用呈下降趋势,类似倒U型,猜测可能与药物本身的毒性有关。

本研究虽然以行为学实验论证了药物与疾病的相关关系,但由于本次实验人力,物力,财力都有限,没有完整的生化实验加以佐证,且实验果蝇的数量并不是很多。得出更加明确的结论还有待于更大样本量和其他不同实验方法中相关研究数据的支持。