丹参酮IIA对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的作用

田新红 徐玉英 郝 莉

(河南中医药大学人体解剖学与组织学胚胎学教研室, 郑州 450008)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病,其发病机制十分复杂,多种因素参与该病的发生和发展,病理学方面主要以黑质多巴胺能神经元大量变性丢失为特征[1]。其中细胞凋亡是PD中多巴胺能神经元死亡的主要形式,诱导凋亡的途径有死亡受体途径、线粒体应激途径以及后来发现的内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)途径。近年来,蛋白质代谢异常导致ERS在PD发病中越来越受到关注[2]。在前期实验显示丹参酮IIA可减轻PD模型大鼠多巴胺能神经元的损伤,其作用机制可能与JNK和p38MAPK信号转导途径有关[3-4]。丹参酮IIA在PD中的具体作用及相关机制尚不明确。本研究采用鱼藤酮制备PD大鼠模型,观察丹参酮IIA对模型大鼠中脑黑质内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78， GRP78)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid protease-3, caspase-3)表达的影响,探讨其作用机制是否与内质网应激反应介导的细胞凋亡有关,从而为PD的临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及模型制备

体质量200～220g的健康雄性SD大鼠60只,由郑州大学实验动物中心提供,随机分为正常对照组、假手术组(Sham组)(n=15)、生理盐水组(NS组)和丹参酮ⅡA处理组(TSA组,n=15)。大鼠适应性喂养1周后开始制作模型,根据文献[5]以及本研究预实验的经验总结,鱼藤酮溶解于葵花油配制成浓度为4mg/ml的乳液,采用颈背部皮下注射鱼藤酮溶液2mg/kg,每天1次,连续30d。模型大鼠出现运动减少、肌肉震颤、全身抖动、四肢僵直等表现提示造模成功[6]。选取30只帕金森病模型大鼠随机分为NS组和TSA组,在最后一次注射鱼藤酮溶液24h后分别在模型大鼠腹腔注射生理盐水1ml和丹参酮IIA 20mg/kg,连续注射14d。假手术组(此组在模型制备时作对照)： 与模型组相同部位注射等量的不含鱼藤酮的葵花油,每天1次,连续30d。正常组(此组在模型制备和药物干预时作对照)： 未作任何处理,正常饲养。

爬杆实验： 根据文献[7-8]以及本研究预实验的经验总结,手持鼠尾,令其倒立(头向下)于50cm长的木杆顶端,木杆外缠有医用胶布以保证足够的摩擦力,用秒表记录大鼠完成爬至杆底(后肢着地)全长所用时间,评分标准如下： 四肢并用,一次顺利从杆上爬下为0分;一步一步螺旋向下爬行兼有后肢滑行行为的为0.5分;上杆后间歇停顿数次后爬下,但可抱紧金属杆的为1分;滑行后掉落的为1.5分;不能抓杆,直接掉落为2.0 分。测量3次取平均值,每次间隔5min。实验大鼠经过提前适应训练4d,记录鱼滕酮注射前3d(取平均值),及注射后7、14、21、28d爬杆时间、状态以进行评分;另外,在模型大鼠腹腔注射生理盐水和丹参酮后第7、14天,测量并记录正常对照组、生理盐水组和处理组大鼠爬杆时间、状态以进行评分。若大鼠中途停止或反向爬行,则不予记录,重新测量。

1.2 实验试剂

鱼藤酮和葵花乳油(美国Sigma公司);丹参酮IIA磺酸钠注射液(每支2ml,10mg)(上海第一生化药业有限公司,批号： H31022558);兔多克隆TH、GRP78、caspase-3抗体(Abcam公司);HRP标记羊抗兔二抗和DAB免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);TUNEL试剂盒(罗氏(Roche)公司)。

1.3 标本的采集

在处理结束24h后,正常对照组、NS组和丹参酮IIA组大鼠给予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,固定后开胸并暴露心,用0.9%氯化钠溶液快速冲洗至肝泛白,流出液体无血色,再用4%多聚甲醛常规灌洗固定,待大鼠全身僵硬后,迅速开颅取出中脑部分，置于4%多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋切片。

1.4 免疫组织化学检测

将各组大鼠中脑组织进行石蜡包埋，切片后依次脱蜡、PBS浸洗、修复、PBS洗涤;滴加50μl 0.3%H2O2,PBS洗涤;滴加血清封闭,37℃孵育20min;分别加一抗(稀释倍数为1∶300),37℃孵育过夜;PBS洗涤,分别加二抗工作液,37℃孵育30min;DAB显色;苏木精复染后依次脱水干燥,中性树胶封片。根据染色强度及阳性细胞百分数的多少进行评分： 染色强度(把强度表现为0分的视为阴性;强度表现为1分的视为弱阳性;强度表现为2分的视为中等阳性;强度表现为3分的视为强阳性);阳性细胞百分率(把无阳性细胞视为0分;阳性细胞<25%的视为1分;阳性细胞25%～50%的视为2分;阳性细胞>50%的视为3分);2项分数之和为0～2分者,计为表达阴性(-),3～4分为弱阳性(+),5～6分者为中度阳性(++),7～9分者为强阳性(+++)。

1.5 TUNEL检测细胞凋亡

检测2组大鼠脊髓背角细胞凋亡的情况。操作步骤参照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。结果判定： 细胞核着棕黄色者为阳性细胞。每个标本观察1张玻片,随机选取5个高倍视野(40×10),每视野计数100个细胞中的阳性细胞数,凋亡细胞阳性指数(AI)=(凋亡阳性细胞数/总计细胞数)×100%。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 外观和行为学改变

正常组及假手术组大鼠皮毛光滑,活动、饮食如常,体质量增长。与正常对照组及假手术组比较,模型组大鼠在注射鱼藤酮7～10d即出现毛色变黄变脏、拒捕行为减弱等表现,随着用药时间的延长,这些症状逐渐加重,且出现主动活动减少、动作迟缓、步态不稳等表现;第19～23天出现不同程度的竖毛、震颤、四肢肌张力增高、协调性差等,之后上述表现愈加明显,自发性活动减少、运动减缓甚至不能。

图1 三组大鼠中脑黑质内TH、GRP78、caspase-3和细胞凋亡的变化,标尺=50μm

爬杆实验结果显示,正常组和假手术组的大鼠均能够四肢并用,一次顺利从杆顶爬到杆底,中间无停留,各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组和假手术组比较,模型组随着鱼滕酮注射时间的延长,大鼠爬竿持续时间逐渐延长,第22天以后,表现为抱杆不稳,不敢下爬甚至不能抱杆、坠落,比较差异均有统计学意义(P<0.01,表1)。在模型大鼠腹腔注射生理盐水和丹参酮IIA后爬杆实验结果显示,与正常对照组比较,NS组大鼠均表现为抱杆不稳,不敢下爬甚至不能抱杆、坠落,比较差异均有统计学意义(P<0.01,表2);与NS组比较,TSA组在注射丹参酮IIA后第7天,大鼠自发性活动明显增多;至第14天,大鼠能够抱杆,但容易滑落,比较差异有统计学意义(P<0.05,表2)。

表1 各组大鼠爬杆实验评分比较分)

**P<0.01vscontrol group and NS group

表2 各组大鼠爬杆实验评分比较分)

*P<0.05vscontrol group and NS group

2.2 TH、GRP 78和caspase-3的表达及细胞凋亡的变化

免疫组织化学检测结果显示,TH、GRP78和caspase-3的阳性表达部位主要分布在细胞质。与正常对照组比较,NS组大鼠中脑黑质内TH的表达降低,GRP78和caspase-3的表达增多;与NS组比较,TSA组大鼠中脑黑质内TH的表达增多,GRP78和caspase-3的表达降低,差异均有统计学意义(P<0.01,图1)。

原位末端标记在凋亡细胞显黄褐色即为阳性细胞。与正常对照组比较,NS组大鼠中脑黑质内有较多的凋亡阳性细胞;与NS组比较,TSA组大鼠中脑黑质内凋亡阳性细胞明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05,图1)。

3 讨论

内质网功能失调导致未折叠蛋白在内质网堆积的一种状态称内质网应激[9]。在ERS初期,细胞可启动生存途径[10],但严重或长时间的内质网应激损伤时,细胞则启动由内质网应激所介导的凋亡信号通路,凋亡途径最终通过caspase-3的活化而实施[11]。GRP78是内质网应激反应的标志性蛋白,其含量的增加表明内质网发生了应激反应。本研究采用颈背部皮下注射鱼藤酮复制PD大鼠模型,随着用药时间的延长,逐渐出现自发性活动减少、运动减缓甚至不能、四肢肌张力增高,协调性差,震颤等典型的行为学表现。免疫组织化学结果显示模型大鼠中脑黑质内TH的表达降低,表明黑质区多巴胺能神经元大量丢失,本实验PD模型复制成功,符合实验要求。

丹参酮IIA是一种从中药丹参中提取的主要有效成分,丹参酮IIA可能具有抗炎和抗氧化能力,对治疗帕金森病有一定价值[12-14]。另有学者报道,丹参酮IIA具有抗凋亡作用[15]。本实验室前期实验结果显示丹参酮IIA可减轻PD模型大鼠多巴胺能神经元的损伤,其作用机制可能与JNK和p38MAPK信号转导途径有关[3-4]。本研究在鱼藤酮制备的PD大鼠模型上观察丹参酮IIA对模型大鼠中脑黑质内TH、GRP78、caspase-3的表达和细胞凋亡的影响,结果显示,与正常对照组比较,生理盐水组大鼠中脑黑质内TH的表达降低,GRP78和caspase-3的表达增多;凋亡染色阳性细胞数目增多。与生理盐水组比较,处理组大鼠中脑黑质内TH的表达增多,GRP78和caspase-3的表达降低,凋亡染色阳性细胞数目减少,差异均有统计学意义,提示丹参酮IIA可在一定程度上阻抑鱼藤酮诱导的PD模型大鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的丢失,其神经保护作用机制可能与减弱内质网应激反应有关。丹参酮IIA可能是一个潜在的治疗PD的药物,在后续试验中将对其与内质网应激介导的生存途径和凋亡途径之间的关系做进一步研究。