食源性金黄色葡萄球菌的耐药机制及检测方法研究进展

韦志萍　解艳秋

【摘要】 金黄色葡萄球菌（SA）可产生多种毒素及多种酶类，易引起人和动物化脓感染、人食物中毒。SA可在食品加工、包装及运输过程污染食品。其耐药机制主要为不合理的使用抗生素和消毒剂。目前，SA对大环内酯类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、环脂肽、糖肽类、唑烷酮类药物及消毒剂均有耐药性，对食源性SA的检测除了传统的“金标准”检测方法外，还有多种基于分子生物学和免疫学的现代检测技术，这些检测技术对食源性SA检测各有优缺点，需多种技术结合以提高其整体检测效果。

【关键词】 食源性金黄色葡萄球菌； 耐药； 检测方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.23.086 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2018）23-0-03

金黄色葡萄球菌（SA）是常见的化脓性感染致病菌，它可产生多种毒素及多种酶类，易引起人和动物化脓感染、人食物中毒[1]。SA可在食品加工、包装及运输过程污染食品，其分泌的毒素对热不敏感，即便加热煮沸30 min仍可致病[2]。近年来，随着抗生素大量使用，SA感染率的升高，耐药率也随之升高，并出现多重耐药性。目前，在医院、社区环境中均存在耐药性强、毒力强的耐药型SA，这给金黄色葡萄球菌感染的防治增加了难度。本文就近年来SA的耐药机制及检测方法进展做一综述。

1 耐药机制

不合理的使用抗生素、消毒剂是SA耐药菌株增加、多重耐药菌出现的主要原因。

1.1 大环内酯类

SA质粒和染色体含有erm基因，这些基因是SA对大环内酯类药产生耐药性的主要原因[3]。erm基因主要有ermA、B、C基因。大环内酯类药的抗菌作用是通过抑制细菌内的核糖体23S rRNA基因活性，阻断蛋白质合成来实现的[4]。其耐药性是因甲基转移酶erm基因催化该基因甲基化，致使药物与RNA亲和力降低而产生[5]。另外，核糖体大亚基23S rRNA碱基、核糖体蛋白L4的突变均可导致大环内酯类药的耐药性[6]。

1.2 β-内酰胺类

SA耐药性的产生是由于其存在一个mecA这一特有的耐药基因，该基因在SA对β-内酰胺类药物耐药方面起着重要作用。SA菌体表面存在一种青霉素结合蛋白，其在细菌生长繁殖中发挥重要作用。因青霉素结合蛋白易与β-内酰胺类抗菌药结合而失去活性，导致细胞壁合成受阻而使细胞凋亡[7]。mecA上有一可移动染色体盒SCCmec中，可编码出新的青霉素结合蛋白。这一新的青霉素结合蛋白与β-内酰胺类药亲和力降低，但它同样可参与细胞壁的合成，故可替代失活的青霉素结合蛋白参与细胞壁的合成，从而产生耐药性[8]。

1.3 氟喹诺酮类

氟喹诺酮类药物对SA的作用靶位酶改变及其在菌体内蓄积量减少是引起耐药性的重要原因。此类药物基本结构为1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，其可抑制细菌的DNA拓扑异构酶、促旋酶的活性，阻断其遗传物质的转录而使其凋亡。研究证实，除了靶酶基因位点突变引起靶酶空间位点变异外，细菌对药物排泄增加、摄入减少引起体内药物蓄积减少也可导致细菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性，其中以排泄增加为主，与排泄相关的基因主要有nor基因[9-10]。

1.4 环脂肽

细胞膜结构和功能改变、基因突变和细胞壁异常改变均是SA对环脂肽耐药的原因。环脂肽杀菌作用是通过影响细胞膜对氨基酸的转运，阻断细胞壁肽聚糖磷壁酸酯质的合成，动作细胞膜去极化来实现[11]。SA对环脂肽的耐药机制为：其一，抗菌作用靶点基因突变，引起药物与细菌结合点减少，造成药物对SA的杀死能力减低而产生耐药性；其二，参与细胞壁合成的相关基因表达升高，造成细菌细胞壁增厚，使药物杀死细菌能力降低而产生耐药性[12]。

1.5 糖肽类

SA对糖肽类药物的耐药性主要与细胞壁增厚、抗生素诱导、青霉素结合蛋白改变、调节基因改变、耐药基因转移、肽聚糖交联减少等。SA细胞的细胞壁中的肽聚糖层存在D-丙氨酰-D-丙氨酰酸残基，其一旦被万古霉素结合，则使大多数药物不能通过细胞壁进入细胞内，从而使药物杀死细胞的能力减弱而产生耐药性[11]；一些糖肽类药物作用于细胞壁会引起青霉素结合蛋白表达增加，细胞壁增厚，使药物进入细菌细胞内的浓度降低，从而降低了对细胞的杀伤力[13]；调节基因改变，如agr基因功能缺失等也会导致SA对糖肽类药物耐药；桂中玉等[14]报道，SA耐药菌株中的耐药基因可从肠球菌质粒转移而来，故耐药基因转移可引起细菌耐药，肽聚糖单体五肽上的酰胺化谷氨酸残基数量减少引起肽聚糖交联减少，肽聚糖单体增加，使更多的万古霉素被结合，造成药物与细菌靶位接触减少；体外实验研究发现，万古霉素耐药菌株在无万古霉素的情况下，其耐药性降低，说明抗生素诱导也可引起细菌耐药性增加[15]。

1.6 消毒剂

外排泵分子、质粒介导的耐药基因qac是SA对消毒剂耐药的重要因素。消毒剂是通过物理和化学途径作用于细胞外部、细胞质等靶点，破坏细胞壁和细胞膜，造成胞内物质外滲、氧化胞内酶等方式而产生杀菌作用，这种作用无选择性。外排泵分子的介导的耐药机制为，消毒剂可致细菌染色体上的norA、norC基因表达上调，增强了SA对消毒剂的抵抗能力[16]。QacR蛋白是qacA基因的负调控因子，当其作用底物存在时，消毒剂可结合QacR蛋白，从而阻止了消毒剂与qacA基因结合，造成qacA表达上调，促进了细胞消除其内的消毒剂[17]。

1.7 唑烷酮类

SA对唑烷酮类药物的耐药机制与存在cfr基因、23S rRNA V 区突变有关[18]。利奈唑胺是常用的唑烷酮类药物之一，它的杀菌作用是通过结合细菌中核糖体肽酰转移酶活性中心，抑制蛋白质的合成来实现[16]。细菌中的核糖体肽酰转移酶活性中心主要由rRNA组成，故其上的RNA突变是SA对利奈唑胺耐药的一个重要因素；另外，23S rRNA V 区上的G2503位点是cfr基因的作用靶点，故存在cfr 基因同样可引起细菌耐药[17]。

2 检测方法

目前，对SA的检测主要包括两个方面：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测及其产生毒素的检测。传统的“金标准”检测方法是经增菌培养、选择性培养后进行鉴定试验，如甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验等，该方法操作简便，费用低，但存在检测时间长、假阴性高、敏感度低等不足。近期，陆续出现一些有关快速、敏感性高的检测SA的方法的报道，主要有分子生物学和免疫学方法（抗原抗体反应）两类，以下对这两类检测方法进行具体阐述。

2.1 分子生物学方法

与免疫学方法相比，分子生物学检测方法对SA新产生的毒素、特异性基因具有明显优势，常见的检测方法有聚合酶链反应（PCR）技术、环介导等温扩增（LAMP）技术、基因芯片。

2.1.1 PCR技术 其通过变性、退火和延伸的基本步骤进行基因体外扩增。mecA基因存在一种活性很低的青霉素结合蛋白，它可与β-内酰胺类药物结合而产生耐药性。SA菌属特异性鉴别基因16S rRNA、23S rRNA、耐热核酸酶基因等可作为检测靶点而用于SA的检测[18]。当传统方法检测SA阴性时，可用PCR检测细菌内毒素以判断是否存在SA感染[19]。

2.1.1.1 多重PCR 普通的PCR只有一对引物，PCR扩增出一个核酸片段，多重PCR则用≥2对引物同时扩增多个核酸片段，既可检测同菌种的不同靶基因，还可同时检测不同菌种，其效率显著高于普通PCR[20]。

2.1.1.2 Real-time荧光定量PCR 其原理是通过检测荧光强度的即时变化以检出样品基因拷贝数，进行无复杂扩增产物后处理过程，该法极大提高了基因检测的特异性，且耗时短、效率高，故被广泛应用[21]。为了进一步提高检出效率，一般需联合多重PCR检出法。有学者用Real-time荧光定量PCR及多重PCR对mecA及nuc基因进行检测，在2 h内即准确检出SA及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[22]。

PCR技术虽然具有高特异性、高敏感性的优点，但检测前需增菌，需要较长的时间，目标DNA提取易被各种因素影响；且高扩增能力和高敏感度常引起检测结果的假阳性，使其临床应用受到影响。

2.1.2 LAMP LAMP是以可识别靶序列上6个位点的4条引物，用有链置换功能的DNA聚合酶，扩增产生茎环结构，对目标DNA大量扩增产生多种片段DNA产物。LAMP具有高特异性的优点，且检测速度快，效率高。

2.1.3 基因芯片 是在支持物（硅片、玻片等）上固定大量针分子，可同时检测和分析样品中的大量序列。其最大特点是可同时检测大量样品，且可用荧光检测大量不同的目标基因。传统的病原菌检测手段多仅用于一种或两种相似的细菌或毒素检测，然而临床上或疾病防治中，患者多伴有多種病原菌感染，这给检测工作增加了难度。

2.2 免疫学方法

2.2.1 免疫磁珠技术 该技术是通过用高度均一的纳米磁珠为固相载体，使抗体或抗原偶联至磁珠上，它是一种免疫捕捉技术，可避免样品中基质的干扰，还可高效敏感检出目标物质。

2.2.2 免疫生物传感器 即集成了生物材料、仿生材料及物理化学换能器并可进行数据分析的一类仪器。换能器类型有光学、电化学、热学、压电等。其原理是利用抗原-抗体间的特异性结合，并把这种反应通过物理化学换能器转化为信息进行传输。

2.2.2.1 压电晶体型生物传感器 是通过测定抗原-抗体特异性反应前后压电质量变化而进行信息转化的一种传感器。相对于ELISA，其具有操作简单、耗时少等优势，但也存在检测敏感度低的不足。

2.2.2.2 表面等离子体共振生物传感器 通过测量抗原-抗体特异性结合前后表面等离子体波的共振吸收峰发生的改变以达到检测目的。与传统检测方法比较，表面等离子体共振生物传感器检测费用较高，其敏感度和稳定性尚需提高。

2.2.2.3 免疫荧光生物传感器 对待测物染色使其释放荧光，或用荧光标记物的抗体与待测物结合后，通过检测其发出的荧光以达到检测目的。由于光纤的光学性能好，传输损耗低，不易受电磁干扰，已有研究者将其用于SA肠毒素B的检测。虽对SA检测的抗原-抗体检测体系无须提取DNA，但由于抗体的成分为蛋白质，因此存在合成困难、不稳定、成本高、分解率高等不足，使其应用范围受到了限制。

食源性SA的感染越来越普遍，主要是由于抗生素的大量使用引起的耐药，不合理的使用抗生素、消毒剂是其耐药主要原因。对食源性SA的检测除了传统的“金标准”检测方法外，还有多种基于分子生物学和免疫学的现代检测技术，这些检测技术对食源性SA检测各有优缺点，需多种技术结合以提高其整体检测效果。

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（收稿日期：2018-03-21）