生殖细胞减数分裂前期Ⅰ染色体标本制作方法改进❋

苏 爱 李艺帆 毋亚仙 刘 颖 徐宏伟△

(青岛大学基础医学院, 1 细胞与分子生物学实验室； 2 2016级医学检验技术专业, 青岛 266071)

人类许多遗传性疾病的发生均是由于染色体减数分裂异常所致[1-2],因此熟练掌握细胞减数分裂过程中不同时期的形态结构变化,是医务工作者必须具备的基本技能,也是医学遗传学传统实验教学项目[3]。在本实验中,生殖细胞减数分裂染色体标本的制作质量是决定该实验教学效果的关键环节。如何提高分裂各期细胞检出率,以方便学生充分利用有限课时,高效快捷地观察生殖细胞各个时期染色体形态学变化,成为制作减数分裂标本首先需要考虑的重点问题。常规制作的减数分裂染色体标本普遍存在分裂相细胞检出率较低、染色体分散不良、不易识别、标本不易保存等缺陷,在一定程度上影响了该实验的授课质量和学生的观察效率。十一酸睾酮(testosterone undercanoate, TU)是一种激素类药物,可促进性器官发育及睾丸生殖细胞分裂[4]。本研究采用十一酸睾酮与秋水仙素联合应用的方法制作减数分裂染色体标本,并在低渗溶液的选择和应用,封片剂的选择等方面加以改进,取得了令人满意的效果,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

十一酸睾酮购自浙江仙琚制药股份有限公司；秋水仙素购自上海阿拉丁科技有限公司；Giemsa、甲醇、冰醋酸等均购自北京国药集团化学试剂有限公司。

1.2 模型建立与分组

6～8周龄雄性昆明种小鼠8只,18～20g。适应性喂养3d后,随机分为4组,包括对照组和低、中、高剂量模型组,每组2只。各模型组分别予以肌肉注射500、750、1000mg/kg十一酸睾酮,对照组注射相应剂量生理盐水。继续喂养48h后,各组小鼠均腹腔注射秋水仙素2mg/kg。2h后,颈椎脱臼处死小鼠,剖开腹腔,迅速分离双侧睾丸,用于生殖细胞减数分裂前期Ⅰ染色体标本制作。

1.3 生殖细胞减数分裂前期Ⅰ染色体标本制作

将分离的小鼠睾丸放入盛有生理盐水的培养皿中清洗,用解剖探针剥去睾丸被膜及脂肪组织,取出富含生精细胞的生精小管,移入预置0.07mol/L KCl低渗溶液的表面皿内。采用眼科镊子将曲细精管分离成线状,再用眼科剪将精细小管剪碎,吸入离心管中,37℃孵育20min。吸弃上清,加入甲醇冰醋酸固定液,定容至10ml。室温下固定20min后,800r/min,离心8min。再次吸弃上清,加入60%冰乙酸3ml软化曲细精管。用吸管轻柔吹打使之融化,再次加入新配制的甲醇冰醋酸固定液,定容至10ml。800r/min,离心8min,富集生精细胞。吸弃上清,加入1ml甲醇冰醋酸固定液吹打均匀。取预置0℃的净化玻片,从20cm 高处垂直滴加上述细胞处理液置玻片上,每张玻片滴加2滴。将玻片移至乙醇灯上快速干燥。Giemsa染液(pH=7.2)染色8min,水洗晾干,无水乙醇脱水,香柏油封片。在光学显微镜下对生精细胞减数分裂前期I染色体细线期、偶线期、粗线期、双线期及终变期等各时期分裂相细胞进行观察并计数。每组观察6张玻片,每张玻片观察5个视野,依据计数结果计算各分裂相细胞的检出率。检出率(%)=每视野分裂相细胞数/每视野细胞总数×100%。

1.4 统计学处理

2 结果

光学显微镜观察结果显示,各干预组分裂相细胞明显增多,且分布均匀,染色体结构紧凑,背景清晰,与对照组比较,均有较大改善。进一步的细胞计数及统计学分析结果显示,对照组非分裂细胞达到55.63%,而500、750、1000mg/kg十一酸睾酮干预组随着十一酸睾酮的应用及其剂量的提高,其非分裂细胞所占比例逐渐降低,分别较对照组显著减少了9.71%、20.58% 和26.64%(P<0.05),其中,750、1000mg/kg十一酸睾酮组与500mg/kg十一酸睾酮组比较,非分裂细胞亦明显减少,而750mg/kg与1000mg/kg十一酸睾酮组之间比较差异没有统计学意义(P>0.05)。分裂各期细胞统计结果显示,750mg/kg十一酸睾酮组偶线期细胞达到22.05%,分别较对照组和500mg/kg十一酸睾酮组增多4.84%和4.70%,差异具有统计学意义(P<0.05)；500、750、1000mg/kg十一酸睾酮组粗线期细胞较对照组分别增多了10.74%、14.73%和20.09%,其中,1000mg/kg十一酸睾酮组较500mg/kg十一酸睾酮组明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)；各组间细线期、双线期及终变期细胞差异没有统计学意义(P>0.05)(表1,图1)。

表1 各组小鼠生殖细胞减数分裂前期I染色体分裂相计数结果

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vs500mg/kg testosterone undercanoate group

图1 光学显微镜观察各组小鼠生殖细胞减数分裂前期Ⅰ染色体分裂相，Giemsa,×400

3 讨论

减数分裂是进行有性生殖的生物在形成成熟生殖细胞的过程中所特有的细胞分裂方式,染色体数目减半和重新组合是其主要特征[5]。减数分裂异常可导致人类许多遗传性疾病的发生,如唐氏综合征(DS)[1]、18-三体综合征[2]、克氏综合征等当今世界范围内发生率较高的新生儿染色体异常疾病,即是由于生殖细胞在进行减数分裂时染色体不能正常分离或染色体额外复制所致。这种不可逆性的新生儿出生缺陷为社会和家庭均造成极大的精神痛苦和经济负担[6]。因此,阐明减数分裂的机制及分裂异常发生机制就显得十分重要。目前,医学院校普遍将减数分裂染色体形态学观察作为医学遗传学传统实验课程对本科生进行重点教授[1],减数分裂染色体标本的制作质量也成为制约该实验教学效果的关键因素。

减数分裂的特殊过程主要发生在第1次减数分裂的前期,即前期Ⅰ。根据染色体形态特点通常分为5个时期： 细线期；偶线期；粗线期；双线期；终变期)[5]。由于减数分裂前期I各阶段独特的分裂相变化,一般选择这一时期的细胞进行染色体标本制作,供本科生观察学习。本科生上课时间有限,因此,满足本科生实验课需求的减数分裂染色体标本应具备以下几方面的条件： (1) 染色体结构清晰,无重叠,易于观察；(2) 标本中有较高比例的分裂相细胞；(3) 5个时期的分裂相细胞均应保持较高的检出率,以方便学生在有限的时间内对每个时期的分裂相细胞进行查找和观察。然而,常规方法制作的生殖细胞减数分裂标本非分裂相细胞数目较多、分裂相细胞检出率较低、细胞染色体堆积,不易辨别,观察效果并不理想。同时,常规方法制作的染色体标本细线期、偶线期和粗线期细胞较多,双线和终变期细胞则几乎不可见,且染色体轮廓不清晰、结构模糊,影响了学生对染色体分裂相的观察质量。

本实验采用肌肉注射十一酸睾酮联合秋水仙素腹腔注射的方法制作小鼠生殖细胞减数分裂染色体标本,以期获得理想的观察效果。十一酸睾酮是一种激素类药物,可促进性器官发育及睾丸生殖细胞分裂和成熟；而秋水仙素的作用主要是是破坏纺锤体微管,以获得更多的分裂相细胞[7]。本实验将十一酸睾酮促进生殖细胞分裂的特性应用到小鼠生殖细胞减数分裂染色体标本的制作过程中,提前48h对小鼠进行十一酸睾酮干预处理,以增加生精细胞分裂相的比例；然后再结合秋水仙素作用小鼠2h,分离小鼠睾丸生精小管中生精细胞,进行减数分裂前期I各阶段染色体形态学观察。结果证实,采用肌肉注射十一酸睾酮联合秋水仙素腹腔注射的方法制作的生殖细胞减数分裂前期I染色体标本,染色体形态结构清楚,背景清晰,观察效果良好,且获得的染色体分裂相细胞较常规制片方法显著增多,其中粗线期细胞在各剂量十一酸睾酮组均表现出良好的检出率,同时,双线期和终变期细胞检出率也分别从0.16%上升为0.54%和0.92%,即平均观察2～3张玻片即有该分裂相细胞检出,而对照组则需要观察5～6张玻片才能观察到双线期和终变期细胞,这显著提高了学生的观察效率及该项目实验教学质量。对于十一酸睾酮最适剂量的选择,本研究认为,750、1000mg/kg 十一酸睾酮干预组染色体标本观察效果与500mg/kg十一酸睾酮干预组有较大差别,而750mg/kg 与1000mg/kg十一酸睾酮干预组之间无差异,因此将750mg/kg十一酸睾酮作为生殖细胞减数分裂染色体标本制作最适剂量。

在减数分裂标本制作过程中,本实验除了引入十一酸睾酮促进生殖细胞分裂外,对低渗溶液处理时间及封片技术也做了相应改进。低渗溶液的处理环节对标本质量具有重要影响。低渗过度易造成细胞破裂,低渗不足则会使染色体分散不良,不易观察。常规制作减数分裂标本时,多采用低渗处理30min的方法,效果不甚理想。本实验采用0.07mol/L KCl溶液,同时将低渗处理时间缩短为20min,可见生精小管细胞可充分吸收水分,适度膨胀但又未达到细胞破裂的程度。这种方法可使染色体不易裂解分散,便于染色观察。此外,常规标本制作过程中常采用中性树胶封片,这种方法易使标本被二甲苯氧化呈酸性而褪色。本实验采用香柏油封片技术,不仅避免了在显微镜观察过程中玻片标本出现划痕等问题,还可使标本重复使用5年不褪色,大大提高了标本的使用时间。

综上所述,采用肌注十一酸睾酮与秋水仙素联合应用的方法制作减数分裂标本,可显著提高生殖细胞减数分裂前期I染色体标本的制作质量和观察效果,对增强医学生业务技能,做好染色体病产前诊断和筛查,减少出生缺陷,提高出生人口素质,具有重要意义,值得广泛推广应用。