卡介苗对阿尔茨海默病模型小鼠行为和炎症因子的影响

张雨微，黄 锐，钱闺唐，郭娜君，朱 迪

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)是中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征是大脑皮层及海马区β-淀粉样肽(Aβ)积累形成老年斑，伴随缓慢的炎性病理改变[1]。卡介苗(bacillus calmette-guérin,BCG)是结核杆菌的减毒活疫苗，具有非特异性免疫刺激作用，可诱导机体产生免疫反应，对机体具有免疫保护作用。已证实新生期小鼠接种卡介苗可以提高认知功能，并诱导突触可塑性增强及神经发生增加[2]。同时，有文献报道卡介苗在小鼠疾病模型中发挥神经保护性作用，如神经退行性疾病帕金森综合征等[3]。我们前期研究发现，AD模型小鼠注射较高剂量的卡介苗，可以改善其认知功能，这促使我们进一步探究卡介苗对AD小鼠炎症水平的改变及接种剂量的影响。本研究拟采用D-半乳糖腹腔注射建立C57BL/6小鼠的AD模型，通过高、低剂量的卡介苗给药，探究其对AD小鼠行为和脑内Aβ的影响，进一步检测炎症因子的变化情况，为卡介苗在AD中的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 12周龄的C57BL/6小鼠32只，体质量(18±2)g，动物饲养在皖南医学院实验动物中心。

1.1.2 实验试剂及仪器 D-半乳糖(麦克林)；Morris水迷宫及视频分析系统(众实迪创)；TNF-α、IFN-γ酶联免疫试剂盒(卡尔文)；DNM-9602酶标分析仪；一抗Aβ42小鼠(博奥森)；二抗小鼠SABC-FICT(博士德)；冰冻切片机(Thermo HM 525NX)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 动物随机分为对照组、AD模型组、卡介苗低剂量组和高剂量组，每组8只。除对照组外，其余各组小鼠均以腹腔注射D-半乳糖(120 mg/kg)，每日1次，连续8周，对照组腹腔注射等体积生理盐水(NS)。卡介苗分别以低剂量(104CFU)和高剂量(105CFU)在实验开始的0周、4周和8周通过皮内注射给药。

1.2.2 旷场实验(Open-field test) 旷场为60 cm×60 cm×45 cm的空旷封闭箱子，底部以标记线分为6小格×6小格，顶部中央安置摄像机，记录小鼠在旷场中的自发行为，每只小鼠记录30 min。

1.2.3 Morris水迷宫实验(Morris-water Maze) Morris水迷宫训练小鼠在一个直径为80 cm的水池内寻找到水下的隐藏平台。实验共4 d，小鼠分别从四个象限面朝池壁放入水池，60 s内找到平台的时间记录为逃避潜伏期，反映小鼠的学习记忆功能[4]。

1.2.4 ELISA检测血清中炎症因子水平 摘眼球取血并分离血清，检测小鼠TNF-α和IFN-γ含量。试剂盒加样200 μL/孔，37℃水浴2 h，加入羊抗小鼠IgG HRP，37℃水浴1 h，加入TMB显色液，避光15 min显色后加终止液，30 min内用酶联免疫检测仪490 nm波长记录读数。

1.2.5 免疫荧光染色 生理盐水灌注后的小鼠取脑浸泡在4%的多聚甲醛溶液中充分固定后，依次浸泡于10%、20%、30%的蔗糖溶液平衡，用冰冻切片机切成40 μm的漂片，用含0.25% Triton X-100的1% BSA在 37℃ 水浴封闭30 min，抗Aβ42小鼠(1∶400)孵育2 h后4℃过夜，第二天取出加入羊抗小鼠555(1∶400)37℃ 水浴2 h，漂洗后将脑片裱于防脱载玻片上，并用甘油/PBS(1∶1)封片，激光共聚焦扫描显微镜拍照[5]。

2 结果

2.1 小鼠在旷场中的自主活动度 与NS对照组相比，AD小鼠在中央区域的活动性降低，直立次数低于对照组，粪粒数增多(P<0.05)，表明小鼠的自主活动和探索能力下降、焦虑水平提升。而卡介苗处理后的小鼠活动性提高(P<0.05)，高低剂量间差异无统计学意义(表1)。表明卡介苗能够提高AD小鼠的活动度、缓解焦虑。

表1 卡介苗对小鼠旷场自主活动的影响

注：与NS对照组相比，*P<0.05；与AD组相比，#P<0.05。

2.2 小鼠在水迷宫中的学习记忆功能 各组小鼠逃避潜伏期逐渐缩短。第3、4天，AD小鼠的逃避潜伏期长于对照组(P<0.05)，而经卡介苗处理的AD小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)(表2)，高低剂量之间差异无统计学意义。提示卡介苗可改善AD小鼠的学习记忆功能。

表2 小鼠定位航行的逃避潜伏期 s

注：与NS对照组相比，*P<0.05；与AD组相比，#P<0.05。

2.3 AD小鼠脑内的Aβ沉积 免疫荧光检测各组小鼠脑内Aβ沉积，结果显示(图1)，D-半乳糖造模的AD小鼠脑内可检测到Aβ斑块，而经卡介苗处理后，小鼠脑内的Aβ斑块面积减少。表明卡介苗缓解了AD模型小鼠脑内的Aβ沉积。

A～C分别为AD组、BCG低剂量组和BCG高剂量组小鼠脑内的Aβ斑块染色；D～F分别为A～C图方框内的放大图像。

图1 小鼠脑内Aβ斑块的检测

2.4 小鼠血清中炎症因子的含量 ELISA检测小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的含量，结果显示(表3)，AD模型小鼠血清中的炎症因子TNF-α和IFN-γ高于NS对照组(P<0.05)，而卡介苗的处理抑制了外周炎症因子的表达，表现为TNF-α和IFN-γ的含量下降(P<0.05)。高低剂量之间差异无统计学意义。

表3 各组小鼠血清中炎症细胞因子的含量 ng/L

注：与NS对照组相比，*P<0.05；与AD组相比，#P<0.05。

3 讨论

AD是以认知能力减退为主要特征的老年性痴呆，其病程与Aβ密切相关，同时炎症细胞因子发生变化，非炎性神经斑块发展为炎性神经斑块[6]。D-半乳糖诱导AD模型是通过引起氧化应激反应，使脑神经元发生退行性变化，出现AD特征[7]。研究表明，卡介苗可以调节机体细胞免疫，影响炎症因子等，而新生小鼠接种卡介苗可以促进其中枢神经发生并增强突触可塑性[2]。我们前期研究证实了AD小鼠接种卡介苗后认知功能得到改善，在本研究中，我们进一步探索不同剂量的卡介苗对AD小鼠行为和脑内Aβ沉积的影响，并进一步检测小鼠血清中两种主要的促炎因子TNF-α和IFN-γ。

结果显示卡介苗处理的AD小鼠行为得到改善，脑内Aβ斑块减少，炎症因子水平下降，提示卡介苗改善AD小鼠的病理变化可能是通过抑制AD小鼠的炎症因子，减轻蛋白的神经毒性来实现的。而高剂量和低剂量卡介苗处理的小鼠各指标统计无差异。在行为学实验中，小鼠进入旷场箱，对新环境产生恐惧；另一方面又喜欢探究，使其在中央区域活动并直立察看[8]。Morris水迷宫反映了空间学习记忆相关的脑区功能，通过逃避潜伏期来评价AD的行为学指标。在本研究中，卡介苗处理的AD小鼠表现出较强的活动度和学习记忆功能，缓解痴呆症状。

目前普遍认为Aβ是AD的发病原因，AD患者脑内可检测到Aβ斑块[9]，经卡介苗处理后则减少，缓解了AD的病理变化。研究发现，AD患者脑内能检测到大量炎症免疫因子，使斑块发展为炎性神经斑块，加重神经损伤[10]。临床发现AD患者血液中TNF-α和IFN-γ升高[11]，因此本实验检测了小鼠血清中这两种因子，发现AD小鼠血清中炎症因子水平高于对照组，而经卡介苗处理后含量下降。表明卡介苗降低了AD小鼠血清中的炎性水平。

在一系列指标的检测中，我们发现低剂量和高剂量卡介苗的处理对AD小鼠行为、斑块及炎症因子的改善作用并无统计学差异。这是因为影响免疫效果的因素很多，包括外部环境因素、疫苗使用因素等，其中免疫程序、免疫途径、免疫剂量等均有影响。一般研究表明[12]，初次免疫通常产生的效应较低，而多次重复后可有效激活细胞免疫，增强机体反应性。同时有研究显示低剂量卡介苗可对机体产生较好的免疫保护作用。因此，在本研究中，低剂量的卡介苗即可有效刺激机体免疫系统，而经过重复接种，再次的免疫应答被有效激活，产生级联反应，与高剂量免疫间的差异无统计学意义。

综上所述，卡介苗能下调AD小鼠血清中的炎症因子水平，减轻Aβ神经毒性，改善AD小鼠的行为活动，可在AD治疗中发挥作用。