针药结合对阿尔茨海默病大鼠额叶皮质BDNF、SIRT1表达的影响

黄 锐，倪进忠，贾元威，丁 见，龚 鑫

(1.皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002；2. 皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 临床药学部，安徽 芜湖 241001)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是与年龄密切相关的中枢神经系统退行性疾病，随着世界人口老年化速度的加快，AD已经严重威胁老年人的健康与生活质量。AD的治疗目前尚无特效手段，而有报道表明电针对改善AD患者的认知功能具有明显效果[1]。天麻素是从中药天麻的块茎中提取的主要成分，有报道[2]天麻素可减轻Aβ蛋白对AD小鼠脑神经元的损害作用从而改善其学习记忆能力。沉默信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在AD的治疗中密切相关，有报道[3]表明BDNF可通过上调SIRT1的表达抑制Aβ蛋白诱导的神经元损伤。关于电针结合天麻素对AD大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达情况尚未见报道。本实验通过电针与天麻素联合治疗，运用免疫组织化学法观察各组大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达情况，旨在探讨针药结合治疗AD的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康SD 雄性大鼠60只，体质量200～250 g，购于浙江省实验动物中心。适应饲养1周后将大鼠随机分为6组：正常组，假手术组，模型组，电针组，天麻素组和针药结合组，每组10只。

1.2 主要试剂 D-半乳糖、Aβ1-40购自美国Sigma公司，天麻素注射液(规格5 mL∶500 mg，购自西南药业股份有限公司，兔抗BDNF与SIRT1及SABC试剂盒均购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 模型制备 模型组、电针组、天麻素组与针药结合组大鼠均腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)，1次/天，连续8周。将Aβ1-40 按说明书溶于生理盐水并置于恒温箱中孵育1周。以上各组大鼠注射结束后，以10%水合氯醛按3 mL/kg麻醉，参照包新民等著作的《大鼠脑立体定位图谱》取前囟后3.5 mm，两侧2.0 mm，深度为2.8 mm，微量注射器注射Aβ1-40(5 g/L)2μL，碘伏消毒，缝合皮肤，术后进行抗感染治疗3 d。正常组大鼠不做处理，假手术组参照模型组分别以同等剂量的生理盐水进行腹腔注射和双侧海马定位注射。

1.4 治疗方法 正常组、假手术组、模型组均不做治疗。电针组参照《大鼠穴位图谱的研制》，取 “百会”、 “大椎” 和双侧“足三里”穴，频率2 Hz，每次30 min，连续4周。天麻素组按10 mg/kg剂量腹腔注射天麻素注射液，1次/天，连续4周。针药结合组穴位电针方法同电针组，腹腔注射天麻素注射液方法同天麻素组，连续4周。

1.5 组织标本制备 各组大鼠均以10%水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔麻醉，剪开胸腔，暴露心脏。沿左心室-升主动脉快速滴注预冷0.9%氯化钠溶液，取脑，置于4℃多聚甲醛溶液中24 h，依次经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

1.6 免疫组化检测 取各组大鼠额叶皮质进行冠状切片，片厚5 μm。按免疫组化试剂盒说明书依次各步骤，封片，镜下观察。每组取额叶皮质冠状切片各20张(每只大鼠随机选取2张)，统计400倍视野下额叶皮质BDNF与SIRT1阳性细胞数和平均灰度值(灰度值越大说明表达越弱，反之则越强)。

1.7 统计学处理 用SPSS 18.0软件进行统计分析，数值变量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组织化学染色结果显示，各组大鼠额叶皮质均可见BDNF与SIRT1阳性细胞，呈棕黄色，主要为胞质和胞膜着色。与正常组比较，假手术组BDNF与SIRT1表达无明显变化(P>0.05)，模型组BDNF与SIRT1呈弱阳性表达，阳性细胞数减少(P<0.05)，着色较淡，平均灰度值增高(P<0.05)；与模型组比较，电针组、天麻素组与针药结合组BDNF与SIRT1阳性细胞数增多(P<0.05)，着色加深，平均灰度值降低(P<0.05)；与电针组或天麻素组比较，针药结合组BDNF与SIRT1阳性细胞数增多(P<0.05)，平均灰度值降低(P<0.05)。见图1、2，表1。

A.正常组;B.假手术组；C.模型组；D.电针组；E.天麻素组；F.针药结合组。标尺=30 μm(SABC法，×400 )。

图1 各组大鼠额叶皮质BDNF的表达

A.正常组;B.假手术组；C.模型组；D.电针组；E.天麻素组；F.针药结合组。标尺=30 μm(SABC法，×400 )。

图2 各组大鼠额叶皮质SIRT1的表达

表1 各组大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达

注：与正常组或假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与针药结合组比较，▲P<0.05。

3 讨论

AD主要病理表现为Aβ蛋白沉积和神经纤维缠结[4]，沉积的Aβ蛋白可诱发氧化应激反应进一步损伤线粒体从而引起细胞功能障碍[5]。BDNF作为神经营养因子家族成员，可促进神经元的修复与再生，并可减少氧自由基对神经元的损伤[6]。SIRT1作为氧化应激损伤中的关键调节因子，在富含线粒体的组织中高表达，可增强组织细胞的抗氧化应激能力[7]。本实验中观察到模型组大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达低于正常组或假手术组，提示可能由于AD大鼠脑组织的抗氧化应激能力下降，进一步造成对额叶皮质神经元的损伤。有报道[8]表明SIRT1可减弱Aβ蛋白沉积从而改善AD小鼠的学习记忆功能。BDNF可通过上调SIRT1的表达而抑制Aβ蛋白诱导的神经元损伤[3]，因此促进BDNF与SIRT1的表达可能是治疗AD的潜在策略之一。

电针对于AD的治疗具有安全无副作用的优势。王康锋等[9]电针治疗AD患者总有效率达到83.33%，明显改善AD患者的认知功能。有研究[10]表明电针可减少Aβ蛋白的生成，改善AD动物模型的认知功能，可能与上调BDNF表达有关。电针可上调SIRT1蛋白的表达，改善AD大鼠海马神经元线粒体超微结构，促进神经元轴突生长，实现对AD大鼠的脑保护作用[11]。中医学认为AD病理机制为髓海失养，血瘀痰浊，阻塞脑络，“百会”和“大椎”均为督脉要穴，有醒脑开窍，去瘀血痰浊之功效，“足三里”为足阳明胃经穴，可补气血，填精益髓[12]，故本实验选取上述穴位进行电针治疗。实验中观察到电针组大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达均上调，提示电针可能通过增强脑组织的抗氧化应激能力，促进神经纤维的良性再生，发挥对神经元的损伤修复作用。

天麻素是中药天麻中含量最高的有效单体成分，具有抗老年痴呆、抗氧化应激等多种药理学效应。天麻素可抑制Aβ蛋白和纤维斑块的形成，进而阻止AD病变的发展[13]。天麻素可通过上调SIRT1的表达，提高组织细胞的抗氧化应激损伤能力[14]。本实验结果显示电针组与天麻素组额叶皮质BDNF与SIRT1的表达强于模型组，尤以针药结合组的表达最为显著，提示电针与天麻素可能通过上调AD大鼠额叶皮质BDNF与SIRT1的表达，增强脑组织抗氧化应激能力，从而达到对AD大鼠的脑保护作用。电针结合天麻素的疗效优于单用电针或天麻素治疗，具有显著的增效作用，这可能是通过提高靶细胞对药物的生物利用度等途径而产生[15]，其具体机制仍需进一步研究。