伯氏嗜木螨线粒体基因组全序列测定研究

孙恩涛，杨邦和，陶香林，叶长江，李朝品

(皖南医学院 检验学院，安徽 芜湖 241002)

伯氏嗜木螨(Caloglyphusberlesei)属无气门亚目(Astigmata)、粉螨科(Acaridae)。该螨性喜高温潮湿，常孳生于潮湿发霉的储藏物，也可侵害中华真地鳖、美洲大蠊等资源昆虫的卵和幼虫，造成相当大的经济损失。在适宜的温、湿度条件下，伯氏嗜木螨大量孳生，可对人们的生活环境造成污染，引起哮喘等变态反应性疾病，甚至可通过某种途径进入人体，导致人体内螨病[1]。本研究测定并分析了伯氏嗜木螨的线粒体基因组全序列。

1 材料与方法

1.1 样品采集、饲养和鉴定 伯氏嗜木螨采自中华真地鳖培养床上的培养料，挑取单个雌螨在实验室(25±1)℃、85%RH、无光照的条件下进行“克隆”培养。经过7～8周的培养后，在解剖镜下直接分离出成螨，一部分制作成玻片标本以作形态鉴定[1]，一部分饥饿24 h后用70% 酒精固定保存，存放于-80℃超低温冰箱。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用传统的酚氯仿提取基因组DNA。同时，利用DNeasy Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)试剂盒进行10个单个雌螨基因组DNA的提取。

1.2.2 引物设计、长片段PCR扩增及测序 用节肢动物线粒体基因的通用引物[2-4]，扩增出线粒体cox1、cob、rrnS和nad4-nad5基因序列，设计上述4个基因片段区间的长片段扩增引物(表1)，反应总体积为50 μL，含LA-PCR BufferⅡ (Mg2+plus) 5 μL，dNTPs 8 μL，引物各1 μL，模板DNA浓度约为100 ng，LA Taq酶0.5 μL (5 U/μL)，加无菌水补足。反应条件为：94℃预变性60 s；98℃变性10 s，退火与延伸在同一温度下进行，55～60℃ 5 min，34个循环，72℃终延伸10 min。通过Long-PCR扩增出大片段后，对纯化后的PCR产物进行步移法测序。

1.2.3 数据处理及分析 用DNAStar 软件包的Editseq和Seqman软件进行序列拼接和组装，得到线粒体基因组全序列。采用Clustal X 2.0软件，参考已测定的椭圆食粉螨线粒体基因组全序列(序列号KC700022)[5]，查找蛋白质编码基因、rRNA和tRNA在线粒体基因组全序列中的位置；用tRNAscan-SE1.23和ARWEN构建tRNA的二级结构进行鉴定[6-7]。假定控制区的二级结构用Mfold Server在线软件构建[8]。

表1 伯氏嗜木螨线粒体基因组扩增所用的PCR引物

2 结果

2.1 线粒体基因组结构和基因排布 伯氏嗜木螨mtDNA为闭合环状分子，其长度为14 273bp(序列号KF499016)，由13个蛋白质编码基因，22个tRNA和2个rRNA基因构成，见表2。

2.2 tRNA基因 伯氏嗜木螨tRNA基因长度为47～63 bp，平均长度为(53.6±3.49)bp。在所预测的二级结构中，仅trnK能形成三叶草结构，trnD等15个基因呈TV-loop结构，trnR等6个基因缺少D-臂，缺失可变臂和配对的茎。

2.3 非编码区 伯氏嗜木螨mtDNA最大的非编码区(LNR)长341 bp，位于trnF和trnS1之间，AT含量为89.4%，高于其他区域。二级结构分析显示，LNR存在类似微卫星的“(AT)n”序列，且存在个体异质性(44～50 bp)。在AT重复序列的下游，是1个富含AT的区域，其AT含量可达94.29%，形成1个茎环结构。紧接AT富集区下游，形成1个含有短的回文序列(5′-ATGTA和TACAT-3′)的茎环结构。同时，在靠近LNR的3′端，还发现了一个稳定的茎环结构，即由一个的连接环(GTTAAAAA)将28 bp的茎和发夹结构连接起来。此外，还预测有3个能稳定形成茎环的二级结构。

表2 伯氏嗜木螨线粒体基因组的结构

inta:间隔区，负值为相邻基因重叠；LNR:最大的非编码区；在次要链上编码的基因用下划线表示。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，越来越多的蜱螨线粒体基因组提交到数据库中，并广泛地应用于蜱螨各个阶元的系统学研究中。本研究获得了伯氏嗜木螨线粒体基因组全序列，长度为14 273 bp，所编码的37个基因，其相对位置与已释放的无气门亚目中椭圆食粉螨、屋尘螨和粉尘螨相一致[9]。

伯氏嗜木螨线粒体tRNA基因具有缺乏T-臂或D-臂的非典型结构，这与真螨总目螨类线粒体tRNA基因的长度显著缩短一致，其是否具有正常的功能，尚需进一步的线粒体转录组学研究。

节肢动物线粒体控制区一般有较高的AT含量，作为复制起点的识别信号poly-T/A和形成潜在的茎环结构等[10]。伯氏嗜木螨LNR的AT含量高，且形成多个潜在的茎环结构。因此，我们推测伯氏嗜木螨线粒体LNR为其线粒体基因组的控制区。本研究测序获得伯氏嗜木螨线粒体基因组全序列，为推动蜱螨分子系统学的研究提供了基础信息。