急性脊髓损伤患者外周血miR-146a和miR-155表达变化及意义

王勤志，高 琨，徐立军，李名武，周 聪，王亚柱

(1. 鄂东医疗集团黄石市中心医院 创伤骨科，湖北 黄石 435000；2. 中国医科大学第四医院 创伤骨科，辽宁 沈阳 110000)

由于神经损伤后具有不可逆性[1]，故急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)具有较高的致残、致死率。研究表明[2]，对于脊髓未完全损伤的ASCI患者，早期采取合理的诊治措施可在一定程度上促进神经恢复，改善患者预后。有研究指出[3]，免疫炎症反应在ASCI病程进展中发挥重要作用。微小RNA(micro RNA，miRNA)作为广泛存在于机体内高度保守的短链非编码RNA，在组织发育、器官形成、代谢等多种生物学功能中发挥重要作用[4]，miR-146a和miR-155作为miRNA重要类型，参与调控了免疫和炎症反应过程[5]。本研究拟对ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155变化进行分析，探讨其在ASCI患者早期病情评估中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月～2016年12月在黄石市中心医院就诊的ASCI患者65例，男性42例，女性23例，平均年龄(50.2±8.6)岁，致伤原因：坠落伤8例，交通事故43例，摔伤12例，重物砸伤2例。损伤部位：颈椎损伤54例，胸腰椎损伤11例。纳入标准：①年龄>18岁，有明确的外伤史，经影像学检查明确；②入院时距离创伤发生时间在8 h内。排除标准：①有严重颅脑损伤者；②心肝肾等重要脏器严重功能障碍者；③既往有脊髓或颅脑损伤史者；④急慢性感染、恶性肿瘤、脑血管疾病、自身免疫系统疾病、血液系统疾病者；⑤近半年内接受过脊髓或颅脑手术者。根据美国脊髓损伤协会制定的分类标准(ASIA标准)分组：完全损伤组(A级)和不完全损伤组(B、C、D级)。完全损伤组22例，男性15例，女性7例，平均年龄(50.8±8.9)岁，损伤部位：颈椎损伤15例，胸腰椎损伤7例；不完全损伤组43例，男性25例，女性18例，平均年龄(49.7±8.4)岁，损伤部位：颈椎损伤28例，胸腰椎损伤15例。同期，选取脊柱创伤但神经功能正常者26例作为脊髓正常组(ASIA标准：E级)，男性19例，女性7例，平均年龄(50.4±8.6)岁，损伤部位：颈椎损伤15例，胸腰椎损伤11例。从体检中心选取健康者40例作为对照组，排除标准同ASCI患者，其中，男性23例，女性17例，平均年龄(48.9±8.1)岁，入选对象性别、年龄等一般资料无差异。本研究通过医院伦理委员会批准，所有入选对象或其家属均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 所有ASCI患者于伤后8 h内采取大剂量甲泼尼龙冲击治疗，先给予30 mg/kg剂量静脉泵注45 min；15 min后按5.4 mg/(kg·h)的剂量持续静脉滴注23 h。所有ASCI患者MRI检查均示有颈或胸腰脊髓压迫，于48 h内进行前路减压植骨内固定手术治疗。所有患者术后随访6个月以上，随访过程中未出现失访病例，并于6个月随访时对神经功能进行评价。

1.2.2 标本采集和处理 所有患者分别于伤后12、24、36、48和72 h时，对照组于体检当日，抽取肘静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，留取血浆，保存于-80℃冰箱以备检。

1.2.3 利用实时荧光定量PCR技术检测外周血中miR-146a和miR-155表达 取血浆，解冻，加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒(购自美国Promega公司)提取总RNA，并检测纯度。利用反转录试剂盒(购自日本Toyobo公司)将总RNA逆转录为cDNA，逆转录条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。用PCR试剂盒(购自日本Toyobo公司)以cDNA模板进行扩增，引物序列见表1。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，56℃ 60 s，74℃ 30 s，连续进行40次循环，每个样品均设3个平行反应复孔。利用2-△△Ct法计算血浆中miR-146a和miR-155相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1 ASCI患者治疗后神经功能恢复情况 术后6个月时，完全损伤组(A级)22例患者中，有3例(13.6%)神经功能改善，16例(72.7%)神经功能无明显改善，3例(13.6%)分别于创伤后10、11和15 d时死亡；不完全损伤组(B、C、D级)43例患者，30例(69.8%)神经功能改善，13例(30.2%)神经功能无改善。

2.2 ASCI患者、脊髓正常组和对照组不同时点外周血中miR-146a表达 与伤后12 h相比，完全损伤组、不完全损伤组和脊髓正常组患者伤后24、36、48和72 h时外周血中miR-146a相对表达量均呈先升高后降低，伤后24 h时达最大值(P<0.05)；四组患者伤后12、24、36、48和72 h时外周血中miR-146a表达量比较：完全损伤组>不完全损伤组>脊髓正常组>对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。

表2 ASCI患者不同时点外周血中miR-146a表达

注：对照组外周血miR-146a水平为1.06±0.10，与伤后12 h相比，aP<0.05；与对照组相比，bP<0.05；与脊髓正常组相比，cP<0.05；与不完全损伤组相比，dP<0.05。

表3 ASCI患者和对照组不同时点外周血中miR-146a表达重复测量方差分析

注：Mauchly球形检验统计量W=0.777，P=0.000。

2.3 ASCI患者、脊髓正常组和对照组不同时点外周血中miR-155表达 与伤后12 h相比，完全损伤组、不完全损伤组和脊髓正常组患者伤后24、36、48和72 h时外周血中miR-155相对表达量均呈先升高后降低，伤后24 h时达最大值(P<0.05)；3组患者伤后12、24、36、48和72 h时及对照组外周血中miR-155表达量比较：完全损伤组>不完全损伤组>脊髓正常组>对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、5。

表4 ASCI患者不同时点外周血中miR-155表达

注：对照组外周血miR-146a水平为1.06±0.10，与伤后12 h相比，aP<0.05；与对照组相比，bP<0.05；与脊髓正常组相比，cP<0.05；与不完全损伤组相比，dP<0.05。

表5 ASCI患者和对照组不同时点外周血中miR-155表达重复测量方差分析

注：Mauchly球形检验统计量W=0.887，P=0.089。

2.4 ASCI患者伤后24 h时外周血中miR-146a和miR-155表达量在鉴别完全性损伤中的价值 ROC曲线分析显示，ASCI患者伤后24 h时外周血中miR-146a和miR-155相对表达量在预测完全性损害时，曲线下面积分别为0.904(95%CI：0.830～0.978)和0.808(95%CI：0.695～0.920)，当分别取2.31和2.52时，灵敏度为72.7%(16/22)和59.1%(13/22)，特异度为93.0%(40/43)和90.7%(39/43)；两者联合时，曲线下面积0.976(95%CI：0.945～1.000)，灵敏度93.0%(20/22)，特异度95.5%(41/43)，见图1。

图1 ASCI患者伤后24 h时外周血中miR-146a和miR-155表达量在鉴别完全性损害中的价值

3 讨论

ASCI作为脊髓外科常见的危重症，包括原发性损伤和继发性损伤，对于原发性损伤，治疗的关键在于尽量控制风险，减少继发性损伤并促进神经功能恢复[6]，科学评估患者病情严重程度对指导治疗尤为重要，但也是脊柱外科研究的重点和难点。目前，临床上判定ASCI严重程度主要依靠临床表现及影像学检查，但该方法对设备及检查条件要求较高，且无法实时观察患者病情变化，同时，由于脊髓休克期时间长短不一，限制了对神经功能的评定[7]。

动物实验表明[8]，大鼠急性脊髓损伤后miRNA表达谱发生变化。miR-146a和miR-155作为miRNA重要类型，在免疫及炎症反应中发挥重要作用，可通过抑制相应的靶分子表达而增加炎症因子生成[9]，本研究尝试对ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155表达进行监测，结果显示，与伤后12 h相比，完全损伤组、不完全损伤组和脊髓正常组患者伤后24、36、48和72 h时外周血中miR-146a和miR-155相对表达量均呈先升高后降低，伤后24 h时达最大值，分析原因，ASCI患者早期继发了炎症反应，而随着治疗措施的干预，在一定程度上抑制了炎症反应，从而减轻了炎症反应，所以出现了miR-146a和miR-155表达量降低。本研究结果显示，不同时点患者外周血中miR-146a和miR-155相对表达量均为：完全损伤组>不完全损伤组>脊髓正常组>对照组，说明miR-146a和miR-155表达与脊髓损伤及损伤严重程度有关，同时，脊髓正常组患者外周血中miR-146a和miR-155相对表达量高于对照组，亦提示脊柱创伤会导致外周血中miR-146a和miR-155表达量升高，但升高幅度要低于ASCI患者。ROC结果显示，ASCI患者伤后24 h时外周血中miR-146a和miR-155相对表达量联合在预测完全性损害时，具有较好的灵敏度和特异度，提示ASCI患者伤后24 h时miR-146a和miR-155表达量可作为评估ASCI患者病情严重程度的参考指标。

综上所述，ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155表达量升高，且随时间而变化，可作为评估患者病情严重程度的参考指标，对指导患者手术时机选择具有一定参考价值，但鉴于本研究样本量有限，尚需进一步开展大规模的临床研究以确证。