Ⅰ型单纯疱疹病毒对牙龈成纤维细胞炎症因子表达的影响

邓 超，薛进朗，郭家奕，王金孟，汪 伟，施六霞，陈传俊

(皖南医学院 口腔医学院，安徽 芜湖 241002)

牙龈炎(gingivitis)是发生于牙龈组织的炎症，表现为牙龈色、形、质的改变，探诊易出血，随着病程的发展其炎性细胞中相关分子的免疫功能发生变化，牙周袋形成、牙槽骨丧失，造成病理性改变从而导致牙周炎(periodontitis)的发生[1]。有研究表明，人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和EB病毒在牙周炎发病中起着重要的作用[2-3]，其通过促炎细胞或非炎细胞释放损害牙周免疫防御的细胞因子和趋化因子，导致更具毒性的牙周细菌的建立[4]。还有学者认为牙周炎的发展取决于疱疹病毒、特异性致病菌及破坏性炎症介质之间的协同作用。

本实验拟通过研究Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)对人牙龈成纤维细胞炎症因子的分泌情况，探讨HSV-1与牙龈炎症之间的相关性，以及是否通过影响牙龈成纤维细胞的生物性能，增加了炎症因子的分泌，从而加剧了牙龈、牙周疾病的发展。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、实验器材及取材 PBS(gibco，USA)；DMEM培养基(HyCIone，USA)；胎牛血清(四季青，杭州)；双抗(gibco公司,USA)；Human IL-6 ELISA Kit(ABclonal，武汉)；Ⅰ型胶原酶(Solarbio,USA)；胰蛋白酶(gibco，USA)；细胞计数仪(Countstar，上海)；二氧化碳培养箱(Thermo,USA)；超净培养台(苏州设备净化有限公司,苏州)；倒置相差显微镜(OLYMPUS,Japan)。

牙龈组织取材于弋矶山医院口腔颌面外科门诊因正畸需要拔牙的患者。取材前征得患者及家属同意。要求患者无全身性疾病，牙龈组织健康。患者年龄14～20岁。HSV-1病毒由安徽医科大学友情提供，病毒滴度为3×105PFU/mL。

1.2 原代培养 酶消化法培养牙龈成纤维细胞：将新鲜取出带有牙龈组织的牙齿投放在预冷的含有5×的双抗的PBS液体中(含青霉素 100 U/mL，链霉素100 mg/L)，2 h内进行实验。在超净工作台中用含有1×双抗的PBS溶液中反复冲洗干净后转移到无菌培养皿中用手术刀轻轻地刮取牙颈部的牙龈组织块。1000 r/min离心5 min。弃上清后，加入含3 mg/mL Ⅰ型胶原酶1 mL，37.5℃每隔5 min振荡，消化40 min，加入少量胎牛血清终止消化。离心后弃上清，加入3 mL DMEM培养液(含10%胎牛血清)，将其置于二氧化碳培养箱(5%CO2,37℃恒温)中孵育，2～3 d换液。

1.3 传代培养 待细胞长至瓶底70%～80%时，PBS冲洗1～2遍，加入少量0.25%含EDTA的胰酶置于5% CO2培养箱，37℃恒温中消化5 min，终止反应后离心去上清，进行常规传代培养。

1.4 HSV-1病毒刺激 筛选生长状态良好的人牙龈成纤维细胞在六孔板中进行铺板，待细胞长满孔的80%～90%，设置1个对照组(正常培养液)，3个实验组(实验组1、2、3 HSV-1刺激浓度分别为1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL)，放入CO2培养箱中继续培养，分别于48、96 h收集一次上清液，上清液放置于-80℃冷冻保存，96 h后提取细胞RNA留作后续实验。

1.5 酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6含量 使用ABclonal公司的ELISA试剂盒(Human IL-6 ELISA Kit)测定细胞上清液中IL-6的含量。按照所提供的实验步骤稀释标准品，准备试剂盒中所提供的酶标板，然后在其中分别加入样本与标准品，进行稀释、洗涤与抗体孵育等操作，最后通过酶标仪进行各组OD值检测，并通过Curve Expert 1.4 软件进行ELISA标准曲线的绘制，并计算出相应的IL-6的含量。

1.6 real-time PCR检测各组IL-6 mRNA的含量 培养96 h后提取培养细胞总RNA，β-actin 为内参照。引物设计参照GenBank 数据库，由上海生工生物工程有限公司设计合成(表1)。real-time PCR 采用20 μL体系，每管3 个副孔，重复3次 。

表1 引物序列

2 结果

2.1 牙龈成纤维细胞的原代及传代 用全消化法培养原代细胞，2周左右汇集达到80%，倒置显微镜下，大多数细胞呈梭形，胞质丰满，核仁清晰可见，呈典型的成纤维细胞样形态。细胞长满时排列成束状，并可见接触抑制现象(图1)。

2.2 加病毒前后细胞的形态学变化 分别用1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL 3种浓度的 HSV-1病毒刺激牙龈成纤维细胞，96 h后倒置显微镜观察细胞形态，与正常对照组相比(图2A)：1×104PFU/mL组细胞形态正常，呈长梭形，无明显改变(图2B)；1×105PFU/mL组细胞出现少量死亡，细胞间间隙增大(图2C)；1×106PFU/mL组细胞出现大量死亡，细胞由长梭形变为圆形，胞核不清晰(图2D)。

图1 原代细胞(×4)

A.正常对照组细胞;B.1×104PFU/mL浓度下刺激的细胞;C.1×105PFU/mL浓度下刺激的细胞;D.1×106PFU/mL浓度下刺激的细胞。

图2 不同病毒浓度刺激后的细胞状态(×10)

2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-6的含量 用Curve E×pert 1.4 软件进行ELISA标准曲线的绘制，结果显示r=0.996，可信度高(图3)。

图3 ELISA标准曲线(r=0.996)

用1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL 3组不同浓度的HSV-1刺激牙龈成纤维细胞，分别于48 h、96 h收集上清液，ELISA检测上清液中IL-6的含量，结果显示：与对照组相比，48 h后3组实验组中IL-6的含量均上升，差异均有统计学意义(P<0.05)；96 h后3组实验组中IL-6的含量也均上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。各实验组96 h IL-6分泌量均高于48 h，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度刺激下上清液中IL-6的含量 ng/L

注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05。

2.4 病毒刺激前后牙龈成纤维细胞IL-6 mRNA的表达 不同浓度HSV-1刺激牙龈成纤维细胞96 h后进行real-time PCR检测，结果表明，与对照组相比，3组实验组IL-6 mRNA的表达量上升，差异有统计学意义(P<0.05)，但1×105PFU/mL浓度组和 1×106PFU/mL浓度组IL-6 mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 96 h后各组细胞中IL-6 mRNA 的表达(RQ)

注：多组间两两比较，符号不同表示P<0.05。

3 讨论

牙周炎的致病因素很多，细菌致病学说中提到牙周炎的发病机制主要由牙周致病菌的毒力因子引起，常见的牙周致病菌包括福赛斯类杆菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌，这些细菌在体外表达多种毒力因子如 Cag E 蛋白、白细胞毒素、脂多糖和细胞致死膨胀毒素等，这些毒力因子加剧了牙周疾病的发生。但细菌致病学说并不能很好地解释牙周病的部位特异性以及间断爆发性等问题，提示除细菌致病学说以外，还存在其他的致病因素，有学者研究表明，在牙周炎患者龈沟液中检测到疱疹病毒，并可以通过牙周基础治疗降低疱疹病毒的感染率[5]；在不同严重程度的牙周炎患者中疱疹病毒的含量随着病变的严重程度而显著增加，疱疹病毒可能在增加疾病的严重程度方面发挥作用[6]。

白细胞介素-6(IL-6)是牙周炎中最有效的促炎细胞因子之一，与牙周炎的发展息息相关。有学者用IL-1β和IL-6 共刺激人牙龈成纤维细胞，发现其显著诱导细胞中STAT3，ERK和JNK的磷酸化，并增强了各种炎症相关分子如MMP-1，MCP-1，IL-1ra，bFGF和VEGF的表达[7]。牙周炎患者的牙龈组织、牙周组织中可检测出大量的IL-6，其IL-6表达水平的增加可能与IL-6启动子甲基化相关[8-9],大量的炎性介质改变了牙龈细胞和牙周膜细胞的生物学性能，加剧了牙周炎症的发展。

在本研究中，选用单纯疱疹病毒(HSV-1)感染实验组细胞，通过将实验前后记录的图片进行对比，发现牙龈成纤维细胞随病毒浓度的增高以及感染时间的延长，细胞数目急剧减少，细胞形态由长梭形变为圆形，出现大量的死亡，而对照组细胞则无以上所述变化，正常生长。此外，经ELISA检测发现，HSV-1感染的实验组均出现了炎症因子(IL-6)的表达，并随着病毒浓度的增大，时间的延长，炎症因子分泌量增多，IL-6 mRNA的表达量在3种浓度的实验组中表达均上调，但在 1×105PFU/mL浓度组和 1×106PFU/mL浓度组并无明显差异，并未随着单纯疱疹病毒刺激浓度的增加而上升，这可能与高浓度病毒导致细胞死亡有关，过多的炎症因子分泌到上清液中，故ELISA检测上清液中IL-6含量上升，但存活细胞中IL-6的mRNA表达量并未增加。

本研究虽然不能证明HSV-1与牙周炎的发生直接相关，但可以确定HSV-1病毒影响了人牙龈成纤维细胞的功能，并导致细胞炎性分泌的改变。疱疹病毒能够在牙龈组织中繁殖，也可能介导对宿主免疫应答的损害，在牙周病的发病机制中发挥作用。因此，在今后预防和治疗牙周炎的同时可能需要同时考虑控制疱疹病毒的影响，以期获得更好的治疗效果。