CRISPR/Cas基因编辑技术及应用

李迪

摘要：CRISPR/Cas系统是古菌、细菌等在长期进化过程中形成的获得性免疫系统。以Cas9蛋白为核心的Ⅱ型系统经改造后成本低、历时短、操作简单，在植物、动物领域都取得了许多成果。本综述介绍了CRISPR/Cas的产生、作用机制、应用前景等，为CRISPR/Cas系统相关研究提供参考。

关键词：CRISPR/Cas；基因定点编辑；分子机制；应用前景

一、发现

CRISPR/Cas系统是广泛存在于古菌、细菌等的一种获得性免疫系統，是这些生物防御病毒、质粒等入侵自身基因组的外源遗传物质的“武器”。1987年日本研究人员首次在大肠杆菌中发现了一些间隔的短回文序列，但尚不了解其意义。2002年Jansen等将这种序列正式命名为CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），即成簇的规律间隔的短回文重复序列。2005年多项研究显示CRISPR的间隔区与噬菌体或质粒序列有高度同源性。2007年Barrangou等发现通过增加和敲除嗜热链球菌中的CRISPR序列可改变该菌对噬菌体的免疫力。科研人员还发现在CRISPR序列周围存在可编码核酸酶、解旋酶等的Cas基因。2012年Jennifer等发现了一个简单的CRISPR/Cas系统，它通过Cas9核酸内切酶以及以CRISPR序列为模板转录出来的两种RNA就可以剪切dsDNA。2013年FengZhang等首次证实CRISPR/Cas9可对人类内源基因进行定向切割。随着研究人员的不懈努力以及科学技术的快速发展，目前CRISPR/Cas技术在植物、动物等领域已经带来了许多优秀成果。

二、结构与分类

完整CRISPR位点依次包括Cas基因，前导区，由短回文重复序列（repeat）和间隔区（spacer）构成的CRISPR序列。上游Cas基因有丰富的多态性，编码蛋白有核酸酶的功能。前导区可看作CRISPR序列的启动子，激活转录。下游CRISPR序列中的回文序列长度一般在21～48bp，可形成发卡结构。[1]间隔区即细菌捕获的外源DNA，相当于细菌建立的“黑名单”，当入侵者再次来袭细菌可立即识别并应答，即所谓的获得性免疫系统。随着多种细菌基因组测序的相继完成，越来越多的CRISPR/Cas系统被发现。目前依据Cas基因可把已发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。研究最为透彻的是Ⅱ型，它包括2个亚型，标记基因为Cas9，编码蛋白含有RuvC、HNH核酸酶结构域。

三、Ⅱ型CRISPR/Cas系统的分子作用机制

不同的CRISPR/Cas系统在执行其功能时所涉及的Cas蛋白的种类及数目不同。Ⅰ型和Ⅲ型系统都需要多种Cas蛋白形成的复合体参与，Ⅱ型系统只需Cas9就能完成对dsDNA的切割。本综述主要介绍Ⅱ型系统的分子作用机制。

（一）外源DNA捕获

外源DNA首次攻击细菌时，Cas基因合成Cas1和Cas2形成蛋白复合体，从外源DNA中切割一段序列（即原间隔序列protospacer）作为二次免疫的“凭证”，插入到宿主原CRISPR序列中成为间隔序列之一。protospacer两端的几个碱基非常保守，通常为NGG，称为原间隔序列邻近基序（PAM）。外源DNA入侵时，Cas1和Cas2蛋白复合体对其扫描，识别PAM序列后完成切割，整合到宿主CRISPR序列5端，形成新的CRISPR序列。

（二）crRNA的合成

当同种入侵者再次攻击宿主细菌时，前导区激活CRISPR序列的转录，其中repeat合成tracrRNA，整个CRISPR序列合成PrecrRNA，二者组成具有二级结构的复合体，招募Cas9蛋白。RNaseⅢ协助选定并切割对应spacer，形成最终crRNA、tracrRNA、Cas9复合体。

（三）靶向干扰

复合体一旦识别到与crRNA互补的protospacer，将结合到对应的PAM附近。使目标外源dsDNA解旋后，crRNA与带protospacer的互补链结合，Cas9的HNH结构域对互补链进行切割，RucV结构域则对非互补链进行切割，产生DNA双链断裂（DSB），外源DNA被沉默，宿主完成二次免疫。

四、CRISPR/Cas基因编辑技术的发展

CRISPR/Cas系统使外源dsDNA产生DSB后将引起HR或NHEJ，实现靶基因的敲入与敲除。传统基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）。ZFNs和TALENs均由DNA结合结构域、核酸酶结构域融合而成，但这两项技术花费高、操作难度大、历时长、易脱靶。CRISPR/Cas系统能对多靶位点同时进行编辑，在Cas9确定的条件下只需要设计特异的guideRNA即可切割，成本低，因此逐渐兴起。

CRISPR/Cas基因编辑技术以crRNA与tracrRNA形成的嵌合分子为原型，设计针对靶位点的sgRNA，介导切割，产生DSBs。Hwang等[2]利用CRISPR/Cas9在斑马鱼胚胎中实现drd3、gsk3b的定点突变，这是TALENs尚不能完成的。WANG等[3]将sgRNA与Cas9mRNA导入小鼠受精卵中，首次在动物体内实现同时敲除2个内源基因即Tet1和Tet2。Niu等[4]以食蟹猴受精卵为材料同样利用此法成功干扰PPARγ和RAG1，首次在灵长类实现CRISPR/Cas9基因修饰。Zhang等给Cas9蛋白加上激活类结构域，成功激活10个人源基因，建立人类sgRNA文库进一步丰富基因组注释。Gao等[5]利用CRISPR/Cas系统完成了4个水稻基因、1个小麦基因的定点编辑，并在T0代获得了水稻PDS基因缺失的纯合突变体。此外该研究组通过在DSB引入HR修复途径实现12bp序列的knockin，使CRISPR/Cas系统在重要经济农作物的育种方面前景更加开阔。Zhu等[6]利用CRISPR/Cas系统对拟南芥11个靶位点成功诱导突变，突变后代经分析符合孟德尔定律。

CRISPR/Cas系统在基因组编辑中最明显的问题就是脱靶现象。gRNA可能会与PAM序列邻近8～12bp区域错配从而对非靶位点进行编辑。因此目前提高精确度是更大程度上发挥CRISPR/Cas系统作用的切入点。CRISPR/Cas系统为基因组定点编辑技术增添了浓墨重彩的一笔，其成本低，历时短，操作简单，多数相关实验室都能进行课题研究。在植物领域内通过对水稻、小麦等重要农作物进行高效的分子育种，使产量、抗性品质达到较理想的状态。在动物领域内通过构建小鼠、灵长类等的突变体，对遗传疾病、肿瘤分子机制的研究与靶向治疗，为人类带来更多福音。

参考文献：

[1]王玮玮，等.CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用[J].畜牧兽医学报，2016，47（07）：12991305.

[2]HwangWY，etal.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（3）：227229.

[3]WANGH，etal.OnestepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Casmediatedgenomeengineering[J].Cell，2013，153：910918.

[4]NIUY，etal.GenerationofgenemodifiedcynomolgusmonkeyviaCas9/RNAmediatedgenetargetinginonecellembryos[J].Cell，2014，156：836843.

[5]GaoCX，etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（8）：686688.

[6]ZhuJK，etal.EfficientgenomeeditinginplantsusingaCRISPR/Cassystem.CellRes，2013，23（10）：12291232.