丁香精油微胶囊工艺优化 及其对冰温猪肉保鲜效果的影响

孙艳文,邵 京,马 蕊,何贝贝,李志成

(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100)

丁香精油的主要成分为丁香酚、乙酰丁香酚和石竹烯等,具有很好的抗菌、抗氧化和保鲜的功效[1],可减缓食品腐败,延长保质期[2]。但精油难溶于水,稳定性较差,易挥发和氧化变质,对其品质及市场价值影响很大。采用微胶囊技术可增强被包裹物质的稳定性,降低挥发性,延长保存期[3],还可达到保护、控释等效果[4],有效克服丁香精油在使用和贮存期间易散失的问题。

目前,制备丁香精油微胶囊的研究大多是以β-环糊精为主要壁材,韩春然等[5]利用超声乳化方法以β-环糊精为壁材,对丁香精油包埋,通过单因素实验和响应面试验,确定了最佳包埋条件:壁芯比6∶1、超声功率65 W、超声时间13.4 min;Maestrello等[6]采用喷雾干燥和冷冻干燥技术对丁香精油在β-环糊精中进行包封,发现冻干技术获得了较高的收率和包封率。β-环糊精虽具有较多优良特性,但不具备抑菌特性。壳聚糖为甲壳素的脱乙酰产物,具有安全、无毒、抑菌、可食及生物降解等多种特性[7]。海藻酸钠是从褐藻植物中提取得到的高分子多糖,具有安全无毒、生物可降解性、生物相容性等特性[8],海藻酸钠属于阴离子聚电解质多糖,其羧基能与二价阳离子交联从而形成凝胶微球[9]。壳聚糖与海藻酸钠在静电作用下可形成聚电解质复合物,有助于提高凝胶微球的载药率和缓释性能[10],因此,壳聚糖与海藻酸钠已成为备受关注的微胶囊制备材料[11]。

冰温保鲜是指将食品贮藏在0 ℃到初始冻结点的温度区域带的一种保鲜方法,与传统冷藏相比,其贮藏温度较低,不会引起食品冻结和营养流失,可以在保持品质的同时延长食品货架期。冰温保鲜已在果蔬、海产品等生鲜食品的保鲜中取得了良好效果[12],然而在肉制品中研究还较少。

本试验以丁香精油为芯材,海藻酸钠和壳聚糖为复合壁材,利用复凝聚法制备丁香精油微胶囊,采用响应面法研究CaCl2浓度、壁芯比、复合壁材比、包埋时间4个因素对丁香精油微胶囊包埋效果的影响,并将优化得到的丁香精油微胶囊应用于冰温猪肉的保鲜,为丁香精油在食品保鲜方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丁香精油 郑州雪麦龙食品香料有限公司;新鲜猪后腿肉 杨凌本香农业产业集团有限公司;壳聚糖(脱乙酰度≥90%,食品级) 西安皓源生物技术有限公司;海藻酸钠、醋酸(食品级) 成都市科龙化工试剂厂;无水乙醇 成都市科隆化学品有限公司。

85-2A数显恒温测速磁力搅拌器 金坛市城东新瑞仪器厂;UVmini-1240岛津紫外可见分光光度计 日本岛津;KR-B型药物振荡器 常德市康仁医疗器械有限公司;SB-5200DT超声清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;ES315高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司;隔水式恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰公司;PB-10型pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;半微量凯氏定氮装置 长天市旭立玻璃仪器厂;喷雾器 余姚市正宇喷雾器厂

1.2 实验方法

1.2.1 丁香精油微胶囊的制备 参考Otsu等[13]的方法,略有修改。以1%(v/v)醋酸为溶剂配制1%(m/v)的壳聚糖溶液,室温过夜,加入一定浓度的CaCl2溶液,并用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至5.4,记为A液。将1%海藻酸钠溶液置于60 ℃下,保温过夜,加入一定比例的稀释后的丁香精油无水乙醇∶丁香精油=10∶1),60 ℃搅拌20 min,记为B液。趁热将B液用喷雾器喷入A液中,经一定时间包埋反应(磁力搅拌1000 r/min),尼龙布过滤微胶囊,并用蒸馏水洗涤多余的CaCl2,室温(25 ℃)下自然晾干12 h,收集微胶囊。

1.2.2 丁香精油标准曲线 用无水乙醇配制不同浓度的(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g/L)丁香精油标准液,在263 nm波长处测定其吸光度。以丁香精油浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制曲线[5]。得到丁香精油浓度对吸光度的标准曲线y=2.7189x+0.0192,R2=0.9918,表明丁香精油在0.04～0.24 g/L范围内与吸光度线性关系良好,此方程可用来测定丁香精油含量。

1.2.3 单因素实验 设定初始的基本工艺参数为壁芯比4∶1(m/m),复合壁材比(海藻酸钠∶壳聚糖)为1∶1(m/m),CaCl2浓度10 g/L,包埋时间30 min,只改变其中一个参数,研究其对丁香花蕾精油包埋率的影响,试验中固定参数采用上一阶段得到的最佳水平。CaCl2浓度选取(以A液记)5、10、15、20和25 g/L;壁芯比9∶1、8∶1、8∶2、8∶3、8∶4和8∶5;复合壁材比分别为3∶5、4∶5、5∶5、6∶5和7∶5;包埋时间15、30、45、60和75 min。

1.2.4 响应面试验设计工艺参数优化 在单因素实验基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,选取CaCl2浓度(A)、壁芯比(B)、复合壁材比(C)、包埋时间(D)四个因素的最优试验范围,以微胶囊的包埋率为响应值,设计4因素3水平试验,确定最佳参数,响应面设计试验因素水平及编码如表1。

表1 Bex-Benhenken设计试验因素及水平编码Table 1 Factors and levels of codeTable of BBD design

1.2.5 包埋率测定

1.2.5.1 表面油测定 取0.200 g微胶囊,置于10 mL容量瓶中,无水乙醇定容,浸润5 min,5000 r/min离心10 min,取上清液于263 nm处测定吸光度值,根据丁香精油标准曲线计算表面油含量。

1.2.5.2 总油测定 取0.200 g微胶囊,置于10 mL容量瓶中,无水乙醇定容,60 ℃、300 W超声60 min,振荡器振荡10 min,5000 r/min离心10 min[14],取上清液于263 nm处测定吸光度值,根据丁香精油标准曲线计算总油含量。包埋率按照公式(1)计算。

式(1)

1.2.6 丁香精油微胶囊对冰温猪肉保鲜效果影响 在无菌操作条件下,将新鲜猪后腿肉去皮去掉筋膜及多余的脂肪,分割成每块100 g,分别均匀涂抹2%的丁香精油微胶囊溶液(pH=4.1)、不含精油的空芯微胶囊(pH=4.1),对照组涂抹等量的无菌水,沥干,放入聚酯托盘里用保鲜袋装好封口,置于-1～0 ℃冰箱中保藏。每隔3 d分别进行感官评定,测定冷却猪肉的pH、挥发性盐基氮(TVB-N)、菌落总数,各组处理均设3个平行,评定方法如下。

1.2.6.1 感官评定 参照GB 2707-2016《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》。样品从冷藏柜取出后,放置20 min恢复至室温,由食品相关专业共10名人员对其色泽、气味、弹性、粘度等指标进行评定,评分标准如表2。

表2 冷却猪肉感官评分标准Table 2 Sensory evaluation criterion for chilled pork

1.2.6.2 pH 参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH的测定》

1.2.6.3 菌落总数 参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

1.2.6.4 挥发性盐基氮(TVB-N) 参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 CaCl2浓度对丁香精油微胶囊包埋率的影响 由图1A可知,当CaCl2浓度为5 g/L时,微胶囊粘连较多,不易成型,包埋率较低;10 g/L的CaCl2制备的微胶囊包埋率最高(70.07%),与其他浓度相比,差异显著(p<0.05)。随着CaCl2浓度的继续增加,包埋率逐渐降低。Ca2+浓度增加有利于微胶囊囊壁的形成,提高囊壁的致密程度,但过高的Ca2+浓度则会使乳液中液滴的自由空间减小而易于聚集,最终导致微胶囊包埋率下降。

图1 CaCl2浓度(A)、壁芯比(B)、复合壁材比(C)和包埋时间(D)对丁香微胶囊包埋率的影响Fig.1 Effects of CaCl2 concentration(A),core-wall ratio(B),ratio of composite wall material(C)and embedding time(D)on embedding rate of clove essential oil microcapsule注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05),相同小写字母表示差异不显著(p>0.05)。

2.1.2 壁芯比对丁香精油微胶囊包埋率的影响 图1B可看出,壁芯比为8∶1 (m/m)时,丁香精油微胶囊的包埋率最高(76.22%),且差异显著(p<0.05),随着芯材的增多,包埋率呈下降趋势。芯材比例的提高在一定范围内可增加芯壁之间的接触面积,提高络合速度,但当芯材含量过高,壁材不能完全吸附芯材而使丁香精油粘附在微胶囊的表面,表面油含量提高,从而降低了包埋率。

2.1.3 壁材比对丁香精油微胶囊包埋率的影响 图1C可知,壁材比为4∶5 (m/m)时,微胶囊的包埋率最高(78.22%),差异显著(p<0.05),包埋率呈现出先增大后减小的趋势。海藻酸钠溶液含有游离的羧基,性质活泼,带负电荷,壳聚糖分子结构中存在带正点的氨基,聚合物离子具有相反的电荷,可通过静电作用聚合[15]。当混合溶液中离子数量在电学上恰好相等时,得到的丁香精油微胶囊包埋率最高[16]。

2.1.4 包埋时间对丁香精油微胶囊包埋率的影响 由图1D可知,包埋率随包埋时间呈现出先增大后减小的趋势,包埋时间为45 min时,微胶囊包埋率最高(79.68%),并且差异显著(p<0.05)。起初精油分子与壁材能有充足的时间包埋,提高了包埋率,而已经包埋的精油随着时间的延长会脱离包埋,使包埋率降低。

2.2 响应面法优化丁香精油微胶囊制备工艺

2.2.1 响应面试验设计及结果 单因素试验基础上,选取CaCl2浓度(A)、壁芯比(B)、复合壁材比(C)、包埋时间(D)4个因素进行响应面试验,以微胶囊的包埋率为响应值,试验分析结果见表3。

表3 响应面设计方案与试验结果Table 3 Design scheme and test results of response surface

2.2.2 模型的建立与响应面分析 以丁香精油微胶囊的包埋率为响应值,利用Design-Expert.V8.0.6软件对表3进行二次多项回归拟合和方差分析,得到如下包埋率与不同影响因素之间的二次回归模型方程与回归模型方差分析(表4)。

表4 响应面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

Y=-159.31+71.16A+29.40B+138.48C+1.75D+1.79AB+23.18 AC-0.189AD-0.80BC+0.047BD+0.26CD-38.20A2-2.37B2-106.03C2-0.022D2

表4可以看出,模型极显著(p<0.0001),失拟不显著(p=0.0727),说明该模型拟合良好,可用于丁香精油微胶囊制备的分析和预测。由方差分析表可知,一次项A、B,二次项A2、B2、C2、D2对丁香精油微胶囊包埋率的影响极显著(p<0.01),一次项D,交互项AC对丁香精油微胶囊包埋率的影响显著(p<0.05)，其三维响应面图见图2。等高线的形状表示相互作用的强弱,如果等高线图趋于椭圆形,则交互作用明显,若趋于圆形,则交互作用较弱[17]。另外,如果一个响应面的坡度趋于陡峭,表明因素条件对响应值的影响较大,反之,因素条件对响应值的影响较小[18]。由图2可知,CaCl2浓度与复合壁材比两者的交互作用最强。CaCl2浓度与壁芯比对丁香精油包埋率的影响较大,其他因素的影响相对较小。

图2 两因素交互作用对包埋率影响的响应面Fig.2 Response surface of the interaction of two factors on the embedding rate

2.2.3 优化工艺参数与模型验证 结合回归模型,得到响应面优化制备丁香精油微胶囊的最佳工艺条件为:CaCl2浓度12.30 g/L,壁芯比6.99∶1 (m/m),复合壁材比为0.82∶1 (m/m),包埋时间47.22 min,微胶囊包埋率预测值为85.22%。为进一步验证模型预测的准确性,同时考虑便于实际操作,将微胶囊的工艺条件修正为:CaCl2浓度12 g/L,壁芯比7∶1 (m/m),复合壁材比0.8∶1 (m/m),包埋时间47 min。

用修正后的条件进行3次验证性试验,得到的丁香精油微胶囊平均包埋率为84.20%,与方程得到的预测值相对偏差为2.52%,表明该模型预测性好,具有较好的适用性。本试验制备的丁香精油微胶囊包埋率远高于高凯等利用饱和水溶液法,以β-环糊精为壁材制备的丁香精油微胶囊的包埋率67%[19],原因在于试验对壁材进行了改进,选用了海藻酸钠与壳聚糖两种带有相反电荷的聚电解质作为复合壁材,并且利用复凝聚法,使水溶液中的复合壁材在静电作用下,将芯材包覆形成微胶囊,丁香精油被海藻酸钠与壳聚糖之间形成的复杂网状结构包裹[20],密封性好,包埋率较高。该方法适于对芯材为非水溶性的固体粉末或液体的包埋[21],尤其是一些不稳定的物质,是一种高产率和高效率的包埋方法,所制备的微胶囊粒径均一,在农业领域有着光明的前景[16]。

2.3 丁香精油微胶囊对冰温猪肉保鲜效果的影响

2.3.1 丁香精油微胶囊对冰温猪肉感官品质的影响 感官评定是衡量鲜肉品质直接、重要的指标,在消费者购买猪肉时起着决定性作用。试验认为当猪肉样品各项感官评分之和等于或小于12分时,猪肉已经没有食用价值。感官评价中发现补充丁香精油微胶囊后不会产生令人不愉悦的异味,在风味上可以被广大的消费者接受。对照组存放到第9 d,表面黏液增多,略有异味,第12 d颜色变暗,气味难闻,第15 d异味更加严重,弹性完全消失,不能接受。空芯组和精油组猪肉仍有较好的色泽、气味、弹性和粘度,保持着较好的新鲜度;猪肉经微胶囊处理后,颜色会稍白一些,一周后颜色渐渐恢复正常,总体评分上丁香精油微胶囊最优,空芯微胶囊次之,对照组最低(图3)。

图3 丁香精油微胶囊对冰温猪肉感官评分的影响Fig.3 Effects of clove essential oil microcapsule on sensory score of pork under ice-temperature注:图中不同字母表示不同保鲜剂处理在同一贮藏时间 于0.05水平差异显著;图4～图6同。

2.3.2 丁香精油微胶囊对冰温猪肉pH的影响 肉类产品动物死亡后,蛋白质会自溶降解生成碱性的胺类物质,糖类则经糖酵解生成乳酸等酸性物质,因此肉类产品的pH变化可以反应其腐败程度[22]。试验初期,空芯组与精油组猪肉的pH均呈现先降低的趋势(图4),推测应与保鲜剂本身pH较低有关。随着贮藏时间的延长,微生物分解蛋白质不断生成生物胺和一些碱性物质,肉样中的酸性物质被中和,碱性物质不断累积,因此3组猪肉样品的pH均缓慢升高。新鲜肉的pH一般在5.8～6.2,正常鲜肉的pH应低于6.2[23]。对照组猪肉的pH在第15 d时达到6.27,超过6.2;空芯组猪肉的pH在第24 d时超过6.2,证明了壳聚糖与海藻酸钠在一定程度上可以抑制微生物的生长;丁香精油的添加,可较长时间抑制微生物活动,显著延缓了猪肉pH的升高(p<0.05),第34 d时猪肉样品变质。

图4 丁香精油微胶囊对冰温猪肉pH的影响 Fig.4 Effects of clove essential oil microcapsule on pH of pork under ice-temperature

2.3.3 丁香精油微胶囊对冰温猪肉菌落总数的影响 菌落总数是用来判定食品被细菌污染程度以及卫生质量的指标。由于鲜肉的自溶,营养物质变得更易获取,细菌数量也随之增加。猪肉降解过程初期是由内源性肌酶引起,后期则依赖于微生物酶[24]。不同处理冷却猪肉菌落总数的变化如图5所示,可以看出,空芯组与精油组冷却猪肉菌落总数均呈现出先下降后上升的趋势,说明空芯微胶囊与丁香精油微胶囊均有一定的抑菌作用。当菌落总数超过6lg CFU/g 时,猪肉判断为不新鲜[25]。对照组猪肉菌落总数先是平稳增长,冷藏12 d后急剧增长,在第15 d时菌落总数已达6.34lg CFU/g,超过上限;空芯微胶囊组菌落总数在第24 d达到6.29lg CFU/g,超过上限;冷藏第9 d开始,精油组的菌落总数显著低于空芯组和对照组(p<0.05),在前25 d都能很好地抑制微生物生长,菌落总数基本保持在5lg CFU/g及以下,第25 d之后,菌数急剧增长,第34 d达到6.35lg CFU/g,说明丁香精油微胶囊可有效抑制微生物繁殖,延缓冷却猪肉的腐败变质。这可能是所制备的丁香精油微胶囊具有缓释效果,冷却猪肉储藏期间丁香精油持续缓慢释放的结果。以菌落总数为评价标准,冰温条件下对照组、空芯组与精油组冷却猪肉分别可保鲜12、21和27 d。

图5 丁香精油微胶囊对冰温猪肉菌落总数的影响Fig.5 Effects of clove essential oil microcapsule on total bacterial count of pork under ice-temperature

2.3.4 丁香精油微胶囊对冰温猪肉TVB-N的影响 TVB-N是评价肉类鲜度的常用的重要指标之一,国家标准规定鲜肉TVB-N≤15 mg/100 g[26]。图6为贮藏过程中各处理组冷却猪肉TVB-N的变化,不同处理猪肉的TVB-N值随着储藏时间的延长逐渐增大,这主要是在酶和微生物的作用下,肉中蛋白质分解产生了氨和胺类等碱性含氮物质。由图6可知,对照组样品的TVB-N值始终高于空芯组与精油组,空芯组与精油组猪肉的TVB-N增长较为缓慢。对照组冷却猪肉TVB-N在第12 d时已经达到16.18 mg/100 g,最先超过标准,说明对照组可保鲜9 d。第6 d开始处理组样品的TVB-N显著低于对照组(p<0.05),第18 d开始,精油组的TVB-N显著低于空芯组(p<0.05),说明空芯微胶囊处理有利于延缓猪肉TVB-N值的升高,而丁香精油微胶囊处理效果更明显。空芯组和精油组猪肉的TVB-N分别在第24和第34 d超过国家规定的鲜肉标准,说明冰温条件下，空芯组和精油组冷却猪肉分别可保鲜21和27 d。

图6 丁香精油微胶囊对冰温猪肉TVB-N的影响Fig.6 Effects of clove essential oil microcapsule on TVB-N of pork under ice-temperature

关于丁香精油的研究多见于对水果和粮食保鲜的研究,肉与肉制品的研究还较少。刘占东等[27]利用包埋质量分数1.0%肉桂精油的肉桂精油壳聚糖纳米粒处理冷却肉,使其在(4±0.5) ℃下储藏期可达到6 d;顾仁勇等[28]发现利用9%牛至精油+9%丁香精油+9%山苍子精油+9%肉桂精油的复合保鲜剂,结合真空包装技术,能使猪肉冷藏(0～4 ℃)时间达18 d。本实验冷却猪肉保鲜期可达30 d,原因一在于对丁香精油进行了微胶囊处理,微胶囊的缓释作用延长了其抑菌的时间;二是本试验所用壁材具有抗菌作用,与丁香精油协同发挥了作用;三是本试验采用冰温条件贮藏冷却猪肉,较普通冷藏温度更低,在确保冷却猪肉不被冻结的情况下能更好地抑制微生物的生长繁殖。

3 结论

本研究通过响应面法优化表明,CaCl2浓度,壁芯比,包埋时间以及CaCl2浓度和复合壁材比的交互作用对丁香精油微胶囊的包埋率影响显著,调整后条件CaCl2浓度12 g/L,壁芯比7∶1,复合壁材比0.8∶1,包埋时间47 min,此条件下丁香精油微胶囊包埋率为84.20%,相对误差小于5%,模型较为合理。冰温下对照组、空芯组以及精油组的猪肉可分别保鲜9、21和27 d。试验所制备的丁香精油微胶囊可显著延长冰温猪肉的保鲜期,在本试验基础上再结合保鲜袋、气调等其他的保鲜技术,预计猪肉保鲜时间还会更长。