小麦EMS突变体的创制与性状鉴定

袁秀芳 王丹峰 殷慧娟 何方 刘树兵

摘要：EMS（甲基磺酸乙酯）诱变育种技术是利用EMS处理种子，使其发生基因突变，在短期内获得有价值的突变体，为育种工作提供丰富遗传变异的一项技術。本研究利用EMS诱变处理小麦品系山农666-2和山农861的种子，在M1代分别收获203、306个单株，种成M2株行；在M2代，每一行收获一个代表性单株，同时收获有明显变异的单株，最终，山农666-2及山农861各收获290、412个单株，种成M3株系。对M3代进行了株高、抽穗期、白粉病、条锈病等性状的调查分析。在山农666-2中，株高变异明显，变异范围为40～80 cm，获得一些高秆、矮秆变异株系；鉴定出一些高抗条锈病或高感白粉病的株系；发现较野生型最早提前2天或最晚延迟14天抽穗的株系。在山农861中，同样获得高秆、矮秆变异株系，株高变异范围在25～85 cm；鉴定出一些高抗白粉病或高感条锈病的株系；抽穗期变异从最早提前3天抽穗至延后11天抽穗。本次诱变处理获得的突变体变异丰富，这为小麦农艺性状相关基因及抗病基因的发掘、克隆及功能研究提供了重要的基础材料，同时也为小麦育种提供了重要的种质来源。

关键词：小麦；EMS诱变；突变体；农艺性状；抗病性

中图分类号：S512.103.52文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0061-06

Abstract EMS （ethyl methane sulfonate） mutagenesis is a technology that uses EMS to treat seeds and cause mutations， so that we can obtain valuable mutants in a short period and provide a large number of germplasm resources for breeding. In this study， the seeds of wheat cultivars Shannong 666-2 and Shannong 861 were treated respectively by EMS， and we obtained 203 Shannong 666-2 and 306 Shannong 861 single plants in the M1 generation， then planted them into M2 lines. In M2 generation， one representative plant in each row and the single plants with significant variation were harvested. We obtained 290 Shannong 666-2 and 412 Shannong 861 single plants， and then planted as M3 lines. In the M3 generation， the traits such as plant height， heading date， resistance to powdery mildew and stripe rust were investigated in the adult plant stage. In Shannong 666-2， the variation of plant height was obvious with the variation range of 40～80 cm， and several high and dwarf mutant lines were obtained； some strains with high resistance to stripe rust or highly susceptible to powdery mildew were identified. It was found that the heading date of some lines was 2 days earlier or 14 days later than the wild type. In Shannong 861， we also obtained several high or dwarf mutant lines， and the plant height range was 25～85 cm； some strains with high resistance to powdery mildew or high sensitivity to stripe rust were identified. And the change in heading date ranged from 3 days earlier or 11 days later than the wild type. The above results indicated that the mutants obtained by this mutagenesis was abundant， which provides important basic materials for the identification， cloning and functional analysis of wheat agronomic trait-related genes and disease-resistant genes， as well as important germplasm for wheat breeding.

Keywords Wheat； EMS mutagenesis； Mutant； Agronomic traits； Disease resistance

小麦是世界三大粮食作物之一，世界上超过三分之一的人口以小麦为主粮。在我国，小麦是北方人口的主要食粮，每年种植面积约2 300万公顷，占全国粮食消费总额的1/5以上，居第三位，仅次于水稻和玉米[1]。近年来，随着我国人口快速增长，城市化进程加快，土地种植面积减少，供求矛盾日益突出，怎样快速提高小麦产量和质量，是目前亟待解決的问题之一。

影响小麦产量的因素很多，如株高、抽穗期、抗病性等。株高通过影响开花期、植株倒伏程度来影响小麦产量[1]；抽穗期是小麦长期适应不同地区和气候环境条件的重要体现，它不仅与生育期密切相关，而且直接影响产量、抗病、抗逆等许多重要农艺性状[2]；另外，近年来以白粉病、锈病为代表的多种小麦病害[3]也严重影响着小麦的产量，发病严重时甚至导致绝收。培育高产抗病、抗倒伏的小麦品种是解决这些问题最有效的途径，而EMS诱变技术是帮助育种家获得有益变异的有效手段之一。

甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfone，EMS）是一种可以改变DNA结构的烷化剂。利用EMS处理种子以构建突变体库是获得优异种质资源的重要途径，具有种质创新频率高、遗传变异谱宽、育种周期短等优点。此外，以EMS突变体为基础，可以快速筛选目的基因突变个体，挖掘新基因，开展功能基因研究[4]。由于EMS诱变技术在突变过程中容易形成点突变且不会造成染色体畸变，因而被广泛用于构建突变体库。如：Kuraparthy等[5]利用栽培一粒小麦（T. monococcum）构建EMS突变体库，筛选到提高小麦有效分蘖的突变株，并进一步发现了控制分蘖的tin3基因；陈洋等[6]用EMS处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642的种子，从M2中筛选出32种不同性状的突变体；沈银柱等[7]利用EMS诱发小麦花药愈伤组织获得耐盐再生植株，并以盐胁迫为选择压力，筛选出一级耐盐品系。除此之外，还成功构建了偃展4110[8]、豫农201[9]、京411[10]等表型变异丰富的突变体库，获得了一些性状优良的突变体，为小麦遗传育种和基因克隆提供了材料来源。

为了构建新的突变体库，进一步丰富小麦遗传育种和功能基因组学的基础材料，本研究利用EMS诱变技术处理两个小麦高产品系山农861及山农666-2的种子，并进行相关农艺性状、抗病性等表型的考察，旨在为小麦新品种选育和基因克隆提供有价值的种质材料，为发掘、鉴定有关农艺性状和抗病性相关基因及其功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山农666-2与山农861均为山东农业大学选育的小麦新品系，由王洪刚教授提供。这两个材料的共同特点是穗大、抗倒伏，同时具有高产、稳产等优点。不同之处在于：山农666-2高抗白粉病，但高感条锈病；山农861高抗条锈病，但高感白粉病。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS诱变处理 在室温下分别用0.30%、0.35%、0.40%和0.45%的EMS各处理500粒山农666-2的种子，置于培养皿中发芽7天，统计各浓度下的发芽率和存活率，以确定最适的EMS处理浓度；用0.35%、0.40%的EMS处理山农861，存活率分别为64.3%、39.2%。以50%的存活率为衡量标准，最终确定山农666-2、山农861的最适EMS处理浓度分别为0.40%、0.38%。两个品系分别处理3 500粒种子，处理方法参见Slade等（2005）[11]的方法。

1.2.2 田间种植、管理与收获 处理过的种子置于培养皿发芽后，于2014年11月种植于山东农业大学实验站，种植密度为行长1.5 m，行距0.25 m，株距0.10 m。2015年成熟时收获所有存活单株的种子，其中，山农666-2收获203个单株，山农861收获306个单株。2015年秋季播种时，每个单株取10～20粒种子，种植于山东农业大学实验站，每个单株种一行，构建成203个山农666-2 M2株行及306个山农861 M2株行。记载材料生长过程中幼苗、叶、茎、穗部等的表型变化，并调查株高、抽穗期、白粉病及条锈病抗性等性状。鉴于M2代同一个株行的不同单株间仍可能存在变异，故收获时，没有出现明显分离的株系，仅收获一个单株；出现明显分离的株系，先收获一个最具代表性的单株作为该株系的代表菌株，再收获具有明显变异的单株。山农666-2共收获290个单株，山农861共收获412个单株。这些单株于2016年秋播时每株取20粒种子，种植在山东农业大学实验站，每个单株种一行，并对其株高、抽穗期、白粉病及条锈病抗性等性状进行调查分析。在M2、M3代种植过程中，每隔20行种植野生型及高感白粉病和条锈病的铭贤169材料各一行作为对照行及感染行，浇水、施肥等管理同正常田间管理。

1.2.3 抽穗期与株高调查方法 在调查抽穗期时，当每一株行中有三分之一的植株已抽穗，且每个穗子抽出三分之二时，确定为该株行的抽穗日期，抽穗期即为播种日期至抽穗日期间的天数。

株高为从基部至主茎顶部即主茎生长点之间的距离。

1.2.4 病害鉴定 白粉病鉴定：由于试验地每年白粉病发病都很严重，白粉病抗性鉴定采用自然发病法。每隔20行种植高感白粉病、条锈病材料铭贤169作为感染行，当其成株期白粉病发病达到4级后，调查白粉病抗性，白粉病分级标准按照盛宝钦等[12]提出的6级反应级别标准（表1）。

条锈病鉴定：采用人工接种鉴定法，按照高盛国等[13]提出的注射接种方法，利用CYR31、CYR32混合菌种进行人工接种鉴定。抗病等级划分采用李振岐等[14]提出的6级标准（表2）。

2 结果与分析

对EMS诱变处理后获得的山农666-2、山农861 M2代株行进行调查发现，M2代出现了多种性状变异，如叶片畸形、穗子畸形、植株矮化、分蘖数变化、抗病性变化、育性降低甚至不育等。进一步对M3代290个山农666-2、412个山农861株系的株高、抽穗期、白粉病及条锈病抗性等进行调查分析，结果如下。

2.1 株高

山农666-2株高约70 cm，经EMS诱变后，M3株系的株高出现2种类型的明显变异（图1、图2a）：一是矮秆突变，株高在65 cm以下的株系共87个，占M3株系总数的30%，平均株高为56 cm，最低株高仅为40 cm；二是高秆突变，株高在75 cm以上的视为高秆变异，共47个株系，占M3株系总数的16.2%，平均株高为78 cm，最高可达80 cm。

山农861株高约68 cm，经EMS诱变后，株高也发生了明显的变异（图1），其中株高在63 cm以下的矮秆变异共73个，占M3株系总数的17.7%，平均株高为56 cm，最矮至25 cm；株高在73 cm以上的高秆变异共有89个，占M3株系总数的21.6%，平均株高为78 cm，最高可达85 cm。

2.2 抽穗期

山农666-2的抽穗期是198天，经EMS诱变后，抽穗期有较大变异（图1）。在290个M3代株系中，有3个抽穗期提前，占比1.0%，其中，有2个株系的抽穗期提前2天，1个株系提前1天；抽穗期延迟的株系较多，共205个，占比70.7%，最晚的延迟14天。

山农861的抽穗期是199天，经EMS诱变后获得了不同抽穗期的突变株系（图1）。其中，70个株系的抽穗期提前1～3天，占比16.9%；287个株系的抽穗期延迟，占比69.7%，最晚的延迟11天。

2.3 白粉病抗性

经EMS诱变后，山农666-2白粉病抗性发生3种类型变异（图1）：①59个株系由高抗突变为中抗，占比20.3%；②23个株系由高抗突变为中感，占比7.9%；③7个株系由高抗突变为高感，占比2.4%。

山农861经EMS诱变后，也发生了3种类型白粉病抗性变异（图1）：①127个株系由高感突变为中感，占比30.8%；②40个株系由高感突变为中抗，占比9.7%；③78个株系由高感突变为高抗以上（图2b），占比18.9%。

2.4 条锈病抗性

经EMS诱变后，山农666-2条锈病抗性发生3种类型变异（图1）：①61个株系由高感突变为中感，占比21.0%；②51个株系由高感突变为中抗，占比17.6%；③41个株系由高感突变为高抗以上（图2c），占比14.1%。

山农861经EMS诱变后，同样出现了3种类型条锈病抗性变异（图1）：①30个株系由高抗突变为中抗，占比7.3%；②6个株系由高抗突变为中感，占比1.5%；③3个株系由高抗突变为高感（图2d），占比0.7%。

2.5 白粉病、條锈病抗性均发生变异的突变

在白粉病和条锈病抗性变异株系中，有些两者同时发生了变异，山农666-2中有4个株系白粉病突变为高感而条锈病突变为高抗，占比1.4%；山农861中有1个株系白粉病突变为高抗而条锈病突变为高感，占比0.2%。

3 讨论与结论

EMS浓度是影响突变体出芽率及变异频率的一个重要因素。赵天祥等[15]分别用0.7%和1.2%的EMS处理小麦品种偃展4110，表型变异率分别为2.9%与3.7%。本研究首先分别利用四种浓度（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%）和两种浓度（0.35%、0.40%）的EMS预处理小麦品系山农666-2和山农861的种子，通过比较各浓度下的发芽率和存活率，确定适合两品种的最适EMS处理浓度分别为0.40%和0.38%，再用最适浓度的EMS处理小麦种子，从而提高了变异频率。但本研究确定的EMS最适浓度与前人的差异较大，可能是因为EMS浓度对基因型不同的材料影响不同。

经EMS诱变处理后的小麦种子，农艺性状和产量性状会发生不同类型的变异，且多为不良突变，优良变异较少。本研究获得了一些有益突变，为了降低突变不稳定性，对M3代突变株系的株高、抽穗期及部分抗病性进行调查，最终获得了多种突变株系。其中，突变株系的最大株高差可达60 cm，因此，对株高差异较大的突变株配制杂交组合，培育大的分离群体，可以加快株高相关基因的定位与克隆。控制小麦抽穗期的基因有三类——春化基因、光周期基因及其他基因，这些基因中的任何一个或几个发生突变都会造成晚熟，这也解释了为什么本研究中抽穗期延后的突变株系远远多于抽穗期提前的，下一步我们可以对抽穗期相差较大的单株进行基因鉴定，寻找控制抽穗期的基因并运用于小麦新品种的培育。

白粉病、条锈病等病害严重影响小麦的产量和品质，选育抗病种质是解决这一问题的有效手段。本研究利用EMS诱变，获得了高抗条锈病及高感白粉病的山农666-2突变株系和高抗白粉病及高感条锈病的山农861突变株系，为小麦抗病基因定位及抗病品种选育提供了材料。

EMS诱变技术不需要进行遗传转化，极易形成点突变且不对染色体造成影响，因而被广泛用于构建变异丰富的突变体库，用于功能基因组学研究中。目前，已经成功构建了拟南芥[16]、玉米[17]、水稻[18]、番茄[19]、大麦[20]等多种植物的多个突变体库，但小麦中构建成功的突变体库还较少。本研究成功构建了两个小麦品种的突变体库，不仅有助于丰富小麦突变体库，而且为株高、抽穗期、白粉病及条锈病抗性等性状的改良提供了种质材料。

参 考 文 献：

[1] 王金平. 小麦关键性状遗传解析及功能标记开发[D]. 泰安：山东农业大学，2017.

[2] Muleisen J， Piepho H P， Maurer H P， et al. Yield stability of hybrids versus lines in wheat， barley， and triticale[J]. Theor. Appl. Genet， 2013， 127： 309-316.

[3] Luo M， Kong X Y， Huo N X， et al. ESTs analysis of resistance to powdery mildew in wheat at primary infected stage [J]. The Crop Journal， 2002， 29（6）： 525-530.

[4] 閆智慧，郭会君，徐荣旗，等.TILLING技术的发展及其在不同植物中的应用[J]. 核农学报，2014，28（2）：224-233.

[5] Kuraparthy V， Sood S， Dhaliwal H S， et al. Identification and mapping of a tiller inhibition gene （tin3） in wheat [J]. Theory Application Genetic， 2007， 114（2）： 285-294.

[6] 陈洋，高兰英，邵艳军，等. EMS诱导小麦易位系YW642突变体的鉴定与分子标记分析[J]. 核农学报，2011，25（4）： 617-621.

[7] 沈银柱，刘植义，何聪芬，等. 诱发小麦花药愈伤组织及其再生植株抗盐性变异的研究[J]. 遗传，1997，19（6）： 7-11.

[8] 赵天祥. 六倍体小麦偃展4110 EMS突变体库的构建及矮秆基因变异检测[D]. 北京： 中国农业科学院，2008.

[9] 徐艳花，陈锋，董中东，等. EMS诱变的普通小麦豫农201突变体库的构建与初步分析[J]. 麦类作物学报，2010， 30（4）： 625-629.

[10]闫智慧. EMS诱发小麦京411突变体库构建及TILLING分析[D]. 北京： 中国农业科学院，2013.

[11]Slade A J， Fuerstenberg S I， Loeffler D， et al. A reverse genetic nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING[J]. Nature Biotechnology， 2005， 23（1）： 75-81.

[12]盛宝钦，段霞瑜，周益林，等.小麦白粉病菌对由前苏联引入的小麦近缘植物的侵染研究[J]. 新疆农业科学，1998 （1）： 18-20.

[13]高胜国，路子云，付秋舫，等. 小麦品种抗条锈病鉴定的两种接种方法[J]. 河北农业科技，1994（2）：17-18.

[14]李振岐，曾士迈. 小麦锈病及其防治[M]. 北京：中国科技出版社，2002.

[15]赵天祥，孔秀英，周荣华，等. EMS诱变六倍体小麦偃展4110的形态突变体鉴定与分析[J]. 中国农业科学，2009， 42（3）： 755-764.

[16]McCalium C M， Comai L， Greene E A， et al. Targeted screening for induced mutations[J]. Nature Biotechnology， 2000， 18（4）： 455-457.

[17]Till B J， Reynolds S H， Weil C， et al. Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING[J]. BMC Plant Biology，2004， 4：12.

[18]Ray S K， Rajeshwari R， Sonti R V. Mutants of Xanthomonas oryzae pv. Oryzae deficient in general secretory pathway are virulence deficient and unable to secrete xylanase[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13（4）： 394-401.

[19]Menda N， Semel Y， Peled D， et al. In silico screening of a saturated mutation library of tomato[J]. Plant Journal，2004，38（5）： 861-872.

[20]Caldwell D G， McCallum N， Shaw P， et al. A structured mutant population for forward and reversegenetics in barley[ J]. Plant Journal，2004，40（1）：143-150.