生脉注射液联合长春新碱对人骨肉瘤细胞增殖影响的研究

伊雅淞 鞠增睿 韩呼日查 李宏远 侯毅鞠

摘 要：目的：通过对人骨肉瘤细胞G292的培养，研究生脉注射液联合长春新碱对癌细胞生长的影响，为进一步研究对抗癌细胞奠定基础。方法：培养人骨肉瘤细胞G292，取对数生长期的细胞进行实验。用不同浓度的生脉注射液，长春新碱，生脉注射液联合长春新碱作用于人骨肉瘤细胞G292。加药培养48小时后，显微镜下进行细胞形态学观察，MTT法测定，药物敏感性检测。结果：细胞形态观察结果显示药物对细胞生长具有抑制作用；MTT法结果显示联合应用抑制率高于长春新碱抑制率；药物敏感性检测结果显示生脉注射液联合长春新碱作用效果为相加作用。结论：生脉注射液联合长春新碱用药对细胞的抑制作用比单独用药更明显，且作用效果为相加作用。

关键词：人骨肉瘤细胞；长春新碱；生脉注射液；联合用药

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）17-0200-02

长春新碱（VCR）是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，针对抗肿瘤细胞具有良好作用[1]。生脉注射液（SM）主要成分为红参，麦冬，五味子。生脉注射液功能主治心悸，气短休克等症状[2]。实验以人骨肉瘤G292细胞株为受试对象，研究生脉注射液和长春新碱及联合应用此两类药物对接受药物作用的人骨肉瘤细胞G292生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

G292细胞株；生脉注射液；长春新碱；新生牛血清；1640培养基。

1.2 细胞培养

配制血清浓度为12.5%的1640培养基，将G292细胞放置温度37±1℃ 5%CO2培养箱中贴壁生长，恢复至对数增长期，在超净台内进行试验。

1.3 试验分组

将细胞共分为A、B、C、三组，分别为空白组，应用生脉注射液组（10、20、50、100μl/ml），应用长春新碱组（5、10、20、50μg/ml），生脉注射液联合长春新碱应用组（生脉30μl/ml联合长春新碱5、10、20、50μg/ml）。

1.4 细胞形态学观察

在加入药品培养48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态及数量，初步判断药物及药物联合应用对G292细胞的影响。

1.5 细胞生长抑制实验

指数生长培养的G292细胞以5×104个细胞/孔的终浓度接种到96孔板，每孔200μl，细胞分别以不同浓度的生脉注射液培养48h后，向每个孔中加入20μL MTT（5mg/ml）。孵育4h后，吸弃培养基，紫色甲瓒晶体溶解于150μL/孔温的DMSO中。使用酶联免疫分析仪测定570nm处的吸光度。细胞的存活率以对照孔的百分比表示。每次测定重复三次，以确保可靠性。

1.6 药物敏感性检测

指数生长培养的G292细胞，以5×104个细胞/孔的终浓度接种到96孔板，每孔200μl，细胞分别以不同浓度的长春新碱（5、10、20、50μg/ml），生脉30μl/ml联合长春新碱5、10、20、50μg/ml用药处理，培养48h后后续操作同1.5，并计算增敏倍数。化疗增敏倍数=单用化疗药物IC50/联合用药时化疗药物IC50。联合治疗效果常采用金正均Q值法评价：Q=EA+B/（EA+EB-EA·EB）。EA代表A药单独给药时的抑制率，EB代表B药单独给药时的抑制率，EA+B代表A、B两药合并给药后的抑制率，0.85≤Q≤1.15为相加作用，Q>1.15为协同作用，Q<0.85为拮抗作用。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

分别加入对应药品培养48小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态如图1。

由图1可见，生脉注射液30μl/ml组的细胞间距增加，长春新碱10μg/ml组细胞数量减少，浓度增加到50μg/ml后，细胞形态异常，生长状态不良。与生脉注射液联合用药后，长春新碱10μg/ml组细胞形态改变显著，细胞边界模糊，细胞内出现大量颗粒，长春新碱50μg/ml组细胞生长状态极差，细胞数量急剧减少，出现大量死亡细胞，成明显抑制。

2.2 细胞生长抑制实验

生脉注射液能有效抑制G292细胞的增殖，如图2所示， 10、20、50、100μl/ml体积分数的生脉注射液作用于G292细胞48h的生长抑制率为15.85%、27.02%、47.53%、63.38%、且其抑制作用呈浓度依赖性。IC50浓度为65.65μl/ml。

2.3 生脉注射液联合长春新碱对G292细胞药物敏感性的影响

选用体积分数为30μl/ml的生脉注射液与不同浓度的长春新碱联合使用，观察生脉注射液对长春新碱抗肿瘤增殖的相加作用，如图3所示，IC50浓度为39.14μg/ml，体积分数为30μl/ml的生脈注射液与不同浓度的长春新碱（5、10、20、50μg/ml）联用Q值分别为0.86、0.97、1.02、0.91。表现为相加作用，IC50浓度为3.04μg/ml，增敏倍数为12.875。

3 讨论

人骨肉瘤发病率在原发性恶性肿瘤中占据首位，该瘤恶性程度甚高，愈后极差且肿瘤细胞原发或继发的耐药问题[3]，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为5～20%。通过研究发现长春新碱是作用于细胞周期的一种特异性药物，一般在S期通过与微观蛋白结合，阻断细胞周期来抑制肿瘤细胞的增殖[4-5]。生脉注射液主要成分为中药红参、麦冬、五味子等，最新研究发现生脉注射液也具有一定的抗肿瘤作用且可以加强化疗疗效、减轻化疗药物的毒副作用、提高患者生存质量。通过本实验结果可知，生脉注射液或长春新碱单药均有抑制G292细胞增殖的作用，药敏分析表明，联合用药效果为相加作用。以本研究结果作为依据，可为临床肿瘤治疗提供更多治疗方案，以此减低肿瘤患者化疗副作用，提高生存质量，但药物联合作用机制需要进一步研究。

参考文献

[1]周洪玉.生脉注射液药效物质基础研究[D].吉林大学，2011.

[2]卢懿，侯世祥，陈彤.长春花抗癌成分长春新碱研究的进展[J].中国中药杂志，2003，（11）：13-16.

[3]王家骐，梅炯，蔡宣松.骨肉瘤化疗的现状和研究进展[J].同济大学学报：医学版，2004，25（6）：538-540.

[4]Novotny N M， Markel T A，Crisostomo P R，et al. Differential IL-6 and VEGF secretion in adult and neonatal mesenchymal stem cells： role of NF-κB[J].Cytokine，2008，43（2）：215-219.

[5]Lecland N， Lüders J. The dynamics of microtubule minus ends in the human mitotic spindle[J].Nat Cell Biol， 2014， 16（8）： 770-778.

[6]Colabufo N A，Berardi F，Contino M，et al.ABC pumps and their rolein active drug transport[J].Curr Top Med Chem，2009，9（2）：119.