芸薹属AC基因组MTP1基因的生物信息学分析

2018-10-29 05:32李施蒙
广东农业科学 2018年9期
关键词:跨膜甘蓝型拟南芥

李施蒙

(西藏自治区农牧科学院农业研究所,西藏 拉萨 850000)

目前,重金属污染已经成为亟待解决的世界性难题,环境中的重金属如Pd、Cr等可通过食物链的传递和富集,最终在人体中累积,破坏正常的生理代谢活动,从而危害人体健康[1]。重金属镉(Cadmium, Cd)是天然存在于自然环境中具有极高生物毒性的重金属元素之一,随着工业化、城镇化的迅速发展,我国土壤环境的Cd含量超标状况日趋严重[2]。重金属镉离子进入细胞需要相应的转运蛋白或者离子通道,但镉不是植物必需的矿质营养元素,因此植物根部对镉离子的吸收主要依靠Zn、Fe、Mn等与其化学结构相似必需元素的转运蛋白或通道[3]。对于植物的生长而言,Zn是不可或缺的矿质营养元素,金属耐受蛋白MTP1(Metal tolerance protein 1)作为一种跨膜蛋白在植物锌离子转运过程中起着重要作用。在十字花科植物拟南芥[4]中最先报道的阳离子转运蛋白(CDF)家族成员MTP1,主要参与锌离子向细胞外的转运[5]。

研究发现,CDF家族广泛存在于细菌、酵母、拟南芥等原核和真核生物中,主要定位于膜体如细菌的细胞膜、植物和酵母的液泡膜以及哺乳动物的高尔基体等膜上[6-7],具有6个跨膜结构域(Transmembrane domain,TMD)[8]。植物中,拟南芥的AtMTP1基因是研究最透彻的CDF家族蛋白[9],MTP1蛋白能将锌离子从细胞质转移到液泡。随后萝卜[10]和水稻[11]中的MTP1基因也相继被克隆,烟草过表达NtMTP1基因后植株对锌胁迫的耐受性显著增强[12]。

目前芸薹属中甘蓝型油菜耐镉胁迫的研究[13-14]已有报道,但对MTP1基因的研究却较少。本研究根据芸薹属AC基因组作物的亲缘物种拟南芥的MTP1基因序列作为基序,在白菜(Brassica rapa)[15]、甘蓝(B.oleracea)[16]、甘蓝型油菜(B.napus)[17]3个物种的全基因组数据库中筛选和鉴定芸薹属AC基因组MTP1基因,并从系统进化、基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位和基因组织表达特异性等方面进行分析,旨在为进一步研究芸薹属作物中MTP1基因参与锌离子转运机制奠定基础,促进低积累重金属芸薹属作物的种质创新和品种改良。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在拟南芥基因组数据库(http://www.arabidopsis.org/)中检索并下载拟南芥MTP1基因的CDS序列。以拟南芥MTP1基因的CDS序列为基序利用芸薹属数据库(http://brassicadb.org/brad/),分别在白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组CDS数据库中进行Blastn搜索(值为1e-100),同时利用在线软件SMART对下载的拟南芥MTP1蛋白序列和Blast检索得到的白菜、甘蓝和甘蓝型油菜MTP1候选基因的蛋白序列进行结构域分析,结合CDF蛋白家族MTP1蛋白序列的结构域特点进一步鉴定芸薹属AC基因组中的MTP1候选基因。

1.2 理化性质及亚细胞定位分析

利用在线分析软件ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)[18]分析芸薹属 AC基因组中的MTP1基因和拟南芥MTP1基因编码蛋白的理化性质,包括分子量(Molecular Weight)、理论等电点(Theoretical pI)、不稳定系数(Instability index)和亲疏水性(Grand average of hydropathicity, GRAVY)等。利用软件Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)对上述MTP1基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测。

1.3 蛋白质二级结构、跨膜结构域、磷酸化位点预测及系统进化分析

利用软件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白质跨膜结构域分析。利用在线分析软件Sopma Secondary Structure Prediction Method(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html)对MTP1基因的蛋白质进行二级结构预测。利用 NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)对蛋白质的磷酸化位点进行预测。利用软件MEGA5.2的邻近法(neighbor-joining,NJ)[19],对芸薹属AC基因组中MTP1蛋白进行系统进化分析,采用p-distance模型,并设置Bootstrap值为1 000进行校正,构建系统进化树。

1.4 甘蓝型油菜BnMTP1不同组织部位的表达模式分析

使用甘蓝型油菜栽培种中双11的转录组数据[20],提取BnMTP1基因在根、茎、叶、蕾、花和种子等组织部位的表达量FPKM值,比较分析其表达模式。

2 结果与分析

2.1 芸薹属AC基因组中MTP1基因家族的鉴定

本研究利用拟南芥AtMTP1基因的CDS序列,通过芸薹属数据库对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜基因组CDS序列进行Blastn同源比对。由于CDF家族中MTP1蛋白含有6个跨膜结构域,对获得的同源序列再使用SMART软件进一步鉴定。结果(表1)表明,在白菜基因组中获得1条序列,位于A03染色体上,命名为BrMTP1A03(Bra000432);在甘蓝基因组中获得3条序列,均位于C04染色体上,分别命名为BolMTP1-1(Bol004901)、BolMTP1-2(Bol014388) 和BolMTP1-3(Bol021804)。在甘蓝型油菜A亚基因组中获得3条序列,分别位于A03、A04和A05染色体上,命名为BnMTP1A03(BnaA03g21530D)、BnMTP1A04(BnaA04g26760D)和BnMTP1A05(BnaA05g01080D);在C亚基因组中获得1条序列,位于C04染色体上,命名为BnMTP1C04(BnaC04g00620D)。这些基因编码序列(coding sequence, CDS)长度为 990~1 437 bp,除BnMTP1A04含有4个外显子外,芸薹属AC基因组中的其他MTP1基因均只含有1个外显子。

表1 芸薹属AC基因组MTP1基因的相关信息

2.2 MTP1蛋白的理化性质及亚细胞定位

利用软件Plant-mPLoc对芸薹属AC基因组中鉴定的MTP1蛋白进行亚细胞定位分析,结果发现该蛋白均定位于液泡,结合拟南芥AtMTP1蛋白定位于液泡膜,故推测这些MTP1蛋白也属于液泡跨膜转运蛋白,助其行使金属锌离子的跨膜转运。

使用ProtParam在线分析工具对MTP1蛋白进行理化性质分析,结果(表2)表明,芸薹属AC基因组中的MTP1蛋白均包含20种常见氨基酸,均不含有硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。蛋白序列长度最短的为329 aa(BnMTP1C04和BolMTP1-1),最长的为478 aa(BnMTP1A04);分子量最小的为36.59 749 ku(BolMTP1-1),最大为53.07 049 ku(BnMTP1A04);等电点(pI)最低为5.69(BnMTP1A05和BolMTP1-2),最高为7.03(BnMTP1A04);稳定性系数最小为32.93(BolMTP1-1),最大为42.23(BnMTP1A04),除BnMTP1A04外均为稳定蛋白(<40);脂肪族氨基酸系数最小为106.46(BnMTP1A04),最大为121.73(BnMTP1C04和BolMTP1-1);带负电荷氨基酸残基数(Asp/Glu)和带正电荷氨基酸残基数(Arg/Lys)最小值分别为37、22(BnMTP1C04和BolMTP1-1),最大值为47、45(BnMTP1C04和BolMTP1-1)。

亲疏水性分析发现肽链总体均表现为疏水性(正值),疏水性系数最小为0.091(BnMTP1A04),最大为0.359(BolMTP1-1),可见这些MTP1蛋白均表现为疏水性,不是水溶性蛋白,这与其属于膜蛋白的特性相吻合。

表2 芸薹属AC基因组MTP1蛋白的理化性质

2.3 芸薹属AC基因组中MTP1基因进化分析及蛋白结构预测

蛋白质的二级结构是连接一级和高级结构的重要纽带和桥梁,它为高级结构分析奠定了基础[21]。使用在线分析软件SOPMA对MTP1蛋白的二级结构进行分析,发现MTP1蛋白主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角等4种结构组成(表3),α-螺旋为主要结构元件,占比接近50%,其次是无规则卷曲和延伸链,β-转角最少。CDF家族中MTP转运蛋白拥有多个跨膜结构域,其二级结构主要由α-螺旋组成,预测结果符合MTP1转运蛋白的基本结构特征。

表3 MTP1蛋白二级结构预测

2.4 MTP1蛋白跨膜结构域和磷酸化位点分析

利用HMHMM Server软件对MTP1蛋白进行跨膜结构域分析,结果(表4)表明,这些蛋白的典型结构特征具有6个跨膜结构域(TM1~TM6)。拟南芥的AtMTP1蛋白第一跨膜区在前60 aa区间内,芸薹属AC基因组的MTP1蛋白中,BnMTP1C04、BolMTP1-1和BolMTP1-2的第一跨膜区均在前60 aa区间内,除了BnMTP1A04外,所有MTP1蛋白的第一跨膜区均是从前60 aa区间开始,BnMTP1A04从155号氨基酸残基开始。MTP1蛋白的6个跨膜结构域中,前4个跨膜域连续串联分布,后2个跨膜域连续串联分布,在第四和第五跨膜区之间有一个长环。

蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的一种重要活性调节机制。使用NetPhos 3.1软件对芸薹属AC基因组中MTP1蛋白的磷酸化位点进行分析,结果(表5)发现白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的MTP1均具有多种不同的磷酸化位点,其中,丝氨酸磷酸化位点(Ser)最多为25个(BnMTP1A04),最少为11个(BnMTP1C04、BolMTP1-1);苏氨酸磷酸化位点(Thr)最多为14个(BnMTP1A04、BnMTP1A05),最少为7个(BolMTP1-2);酪氨酸磷酸化位点(Tyr)只在甘蓝BolMTP1-2中具有1个,其他MTP1蛋白均不具有酪氨酸磷酸化位点。说明MTP1蛋白的磷酸化主要以丝氨酸和苏氨酸磷酸化为主。

表4 MTP1蛋白跨膜结构域预测

表5 MTP1蛋白的磷酸化位点分析

2.5 MTP1蛋白系统进化分析

使用MEGA5.2软件的NJ法构建芸薹属AC基因组MTP1的系统发育树,结果(图1)表明,甘蓝型油菜BnMTP1A03与白菜BrMTP1A03、BnMTP1C04与 甘 蓝BolMTP1-1、BnMTP1A04与BolMTP1-3分别聚类在同一个分支上,说明其遗传距离最近;BnMTP1C04、BolMTP1-1又与BnMTP1A05聚类在一个分支上,说明其遗传距离较近;而AtMTP1和BolMTP1-2分别在单独一个分支上。根据氨基酸构建的系统进化树,也反映其同源进化的亲缘关系,甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A03与白菜A基因组的BrMTP1A03亲缘关系最近;甘蓝型油菜C亚基因组的BnMTP1C04与甘蓝C基因组的BolMTP1-1亲缘关系最近,同时与甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A05亲缘关系较近;而甘蓝型油菜A亚基因组的BnMTP1A04与甘蓝C基因组的BolMTP1-3亲缘关系最近,说明甘蓝型油菜在继承白菜和甘蓝基因组的同时,不同亚基因组之间发生融合重组事件。

图1 芸薹属AC基因组MTP1蛋白的系统进化树

2.6 甘蓝型油菜BnMTP1基因不同组织部位表达模式分析

为了进一步从基因表达水平上研究MTP1基因的表达模式,利用已发表的甘蓝型油菜栽培种中双11的转录组数据,分别提取根、茎杆、幼叶、成熟叶、花蕾和花后10 d、21 d、30 d种子中BnMTP1基因表达量的FPKM值进行比较分析。如图2所示,在甘蓝型油菜中MTP1基因在不同组织部位中均有表达,BnMTP1A03和BnMTP1A05在花蕾中的表达量最高,而BnMTP1A04和BnMTP1C04在花后10 d种子中的表达量最高;BnMTP1A04和BnMTP1A05在根中的表达量最低,BnMTP1A03和BnMTP1C04在花后30 d种子中的表达量最低。甘蓝型油菜中4个BnMTP1同源基因的表达水平也存在明显差异,BnMTP1A04表达水平相对最高,明显高于其他3个基因,BnMTP1A03的表达水平相对最低。

图2 油菜BnMTP1基因表达模式分析

3 结论与讨论

近年来有关植物重金属跨膜转运载体的研究取得重要进展[22],如HMA、ABCA、CAX等转运金属离子跨膜运载蛋白的基因已有报道,根据其位于不同组织细胞和不同细胞器,分为金属离子输入蛋白(Metal uptake protein)和金属离子输出蛋白(Metal efflux protein),分别介导金属离子进入和泵出胞质。而且这些基因的过量表达对金属在细胞中的运输、分布和富集及提高植物的抗性方面发挥了重要作用[23]。目前研究较为深入的主要有CDF家族[24]、ZIP(Zinc-Iron Regulated Transproter Proteins)家 族、Nramp(Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins)家族、重金属ATP酶(HMAs)、ABC(ATP-Binding Cassette)转运蛋白以及金属阳离子/H+反向运输器等[25-26]。本研究旨在从生物信息学层面解析芸薹属AC基因组中CDF家族成员MTP1基因和蛋白的特性,为后续研究其分子功能奠定基础。

MTP1蛋白在植物中普遍存在,且仍不断有新的CDF家族蛋白被鉴定[27],对其研究也不断深入,但MTP1蛋白的结构和功能机制还有较多未知,有待进一步研究。结构上MTP1蛋白的三维结构分析仍然处于使用模型分析软件进行推测阶段,杨树中负责转运锌离子的PtMTP蛋白在体外形成一个寡聚同系物[28],其可被二硫苏糖醇破坏,说明二硫键可能在其形成过程中起到一定作用,MTP蛋白很可能是以同型二聚体的形式存在并发挥功能。本研究通过比对芸薹属白菜、甘蓝和甘蓝型油菜等物种的基因组,在AC基因组中共鉴定到8个MTP1基因,并对其蛋白质一级、二级结构进行分析,发现这些MTP1蛋白含有20种常见氨基酸,二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主,跨膜结构域预测发现均含有6个跨膜结构域,与已有文献报道一致,属于膜蛋白。功能上MTP1蛋白不仅有转运金属离子的作用,在抵抗重金属胁迫过程也扮演重要角色,用于解除过度积累的金属对生物的毒性,还可能用于促进离子传递的信号转导[29]。对芸薹属AC基因组MTP1蛋白进行理化性质分析,发现均为稳定性蛋白,表现为疏水性,这与其属于膜蛋白的特性相吻合,利于执行转运金属离子的功能。

拟南芥AtMTP1 基因[30]和苜蓿MtMTP1[31]基因主要在幼嫩的叶片中表达,水稻OsMTP1基因[33]主要在成熟老叶和茎中表达,烟草NtMTP1基因[12]则主要在花和叶片中表达,根、茎和种子中的表达量较低。本研究中甘蓝型油菜BnMTP1基因在花蕾和花后10 d种子中的表达量较高,根和茎的表达量最低,其次是叶片。甘蓝型油菜BnMTP1基因在不同的组织部位中均有表达,地上部分的表达高于根部的表达,说明地上部分的金属离子转运更活跃。这些结果为进一步研究芸薹属植物MTP1转运蛋白的功能和转运机制奠定基础,目前甘蓝型油菜BnMTP1转运蛋白的研究较少,若通过基因工程等分子技术实现甘蓝型油菜对重金属镉的富集,将推进新用途油菜的开发利用,为重金属污染的生态修复提供帮助。

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