高产乙偶姻酵母菌种的选育与提高白酒中四甲基吡嗪含量的研究

陈诗佳，李玲玲，陈叶福，肖冬光

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457)

四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine,TTMP），又名川芎嗪，分子式为C8H12N2，结构式如图1所示。TTMP作为中药材川芎根茎的主要活性生物碱成分[1]，具有治疗心脑血管疾病，抑制血小板集聚和保肝护肝的药理作用。TTMP在白酒中具有较低的风味阈值，能对其他香味物质起到明显的烘托叠加作用，丰满白酒的香气。TTMP不但对白酒风味有重要的贡献，同时也赋予了中国白酒有益健康的功能，即适度饮酒可以预防心血管疾病、II型糖尿病等，降低心肌梗死的风险[2]。

自然界中存在的TTMP主要是通过食物加热过程中的美拉德反应生成，而且吡嗪类作为食品添加剂是安全的。白酒生产中的TTMP是由微生物代谢产生前体物质乙偶姻和氨，然后乙偶姻和氨反应生成TTMP，其中后者为自发的热力学过程[3]，见图2。白酒中TTMP的含量大多在每升几微克到几十毫克之间，其中酱香型白酒、芝麻香型白酒和兼香型白酒的含量显著高于其他香型白酒。其主要原因是这些白酒的酿造过程都有一个开放式的堆积培养过程，在此过程中，芽孢杆菌等细菌大量繁殖，代谢产生乙偶姻和氨，在较高温度下合成TTMP。施小明等[4]从双沟酒堆积醅中筛选得到3株枯草芽孢杆菌，制成单菌株麸曲应用到白酒生产中，白酒中TTMP的含量分别是对照的5.99倍、4.70倍和3.67倍。朱兵峰等[5]则分别筛选了1株枯草芽孢杆菌和3株地衣芽孢杆菌，在利用还原糖发酵过程中，通过弱酸胁迫和补加葡萄糖的策略，同时控制两个发酵阶段的搅拌转速，积累并提高了前体物质乙偶姻的利用率（40.3%），进而提高了TTMP的产量。徐岩等[6]将具有相应酿造功能的微生物菌剂进行复配组合，使用组合微生物菌剂的芝麻香型白酒头段酒中的吡嗪类物质提高了33.6%。袁建国等[7]以4.5%的比例添加芽抱杆菌B-010，使芝麻香型白酒中TTMP的含量由0.4 mg/L提高到1.8 mg/L。

图1 2,3,5,6-四甲基吡嗪结构式

图2 白酒生产中四甲基吡嗪的形成途径

如前所述，目前对白酒中TTMP的研究大多集中在高产TTMP菌株的筛选上，筛选的菌株大多为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，这两类菌株都是好氧菌种，且只有在pH值接近中性的条件下才有较高的TTMP产量。而实际的白酒发酵过程是在厌氧和高酸度环境下进行的，这两类菌种进入发酵窖池后其生长和代谢很快停止，使其应用受到了很大的限制。只有将这两类菌种在发酵窖池外有氧发酵培养才能生成较高的TTMP产量，因而这些方法一般仅适合于具有窖外堆积培养过程的酱香型白酒和芝麻香型白酒等的生产。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在厌氧和耗氧条件下生长繁殖，且在厌氧条件下酒精发酵能力更强，同时具有耐酸的特点，它是各类发酵食品的主要功能菌。酿酒酵母酒精发酵过程中，TTMP的前体物质乙偶姻是由缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸通过氧化脱羧反应生成双乙酰后，再由双乙酰还原酶作用合成的，但生成的乙偶姻会在2,3-丁二醇脱氢酶作用下被还原合成2,3-丁二醇。因此普通的酿酒酵母不会积累乙偶姻，最终在发酵食品中也不会合成较高TTMP含量。利用分子育种技术构建积累乙偶姻的酿酒酵母工业菌株，即可实现在酒精发酵的同时获得较高的TTMP含量，对提高白酒等发酵食品行业的风味质量和健康因子含量具有双重意义。

1 酿酒酵母乙偶姻代谢与调控

在酿酒酵母发酵过程中，乙偶姻主要是由酵母自身代谢合成的，具体代谢途径如图3所示[8]。与其他菌株不同，酿酒酵母中还存在另一条比较弱的乙偶姻合成途径，即丙酮酸在丙酮酸脱羧酶系(PDCs)催化下转化成乙醛，乙醛同样又会在PDCS催化下通过缩合反应转化成乙偶姻[9]。酵母繁殖过程中细胞内的丙酮酸经过乙酰乳酸合成酶的作用生成α-乙酰乳酸，一部分α-乙酰乳酸留在细胞内进行缬氨酸代谢，经过羟酸还原异构酶（RI）的作用生成α,β-二羟基异戊酸，再生成α-酮异戊酸，最终生成缬氨酸。而另一部分α-乙酰乳酸被分泌到酵母细胞外，经过自身非酶促的氧化脱羧反应合成双乙酰，生成的双乙酰被酵母重新吸收，在酵母细胞内通过双乙酰还原酶的作用将其还原成乙偶姻[10]，然后由2,3-丁二醇脱氢酶在NADH和NADPH的辅助作用下又会被还原为2,3-丁二醇，再次分泌至细胞外[11-13]。

根据酵母中乙偶姻的代谢网络来分析，我们应该从增强乙偶姻的合成和降低前体物质分解两方面来加强乙偶姻的积累。Gonzalez等[15]通过敲除ADH1、ADH3和ADH5基因后相比于原始菌株提高了乙偶姻的产量，但是其乙醇生成量大大减少。还有人希望通过构建PDC缺失菌株，大量积累中间产物丙酮酸来提高乙偶姻生成量，但是PDC系基因的敲除使得菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中无法生长，且影响了菌株生成赖氨酸和脂肪酸的能力。在缬氨酸代谢分支途径中α-乙酰乳酸具有合成双乙酰的能力，生成的双乙酰通过关键酶双乙酰还原酶作用生成乙偶姻。因此对于白酒生产中控制酿酒酵母生成乙偶姻的能力，我们可从以下三方面进行[16-18]：（1）加强乙偶姻前体物质的合成，即增加丙酮酸到α-乙酰乳酸的合成通路；（2）加强乙偶姻的合成，即增加双乙酰到乙偶姻的合成通路；（3）减弱乙偶姻的分解，即减少乙偶姻到2,3-丁二醇的转化，从而提高乙偶姻的产量。

2 重组菌株与出发菌株生长、发酵性能的比较

以酿酒酵母AY为出发菌株，采用同源重组的方法对酿酒酵母乙偶姻代谢相关基因进行敲除或过表达即可获得高产乙偶姻重组菌株，如表1。

图3 酿酒酵母中乙偶姻的代谢流程图

表1 高产乙偶姻重组菌株

2.1 重组菌株与出发菌株生长性能的比较

对出发菌株AY和重组菌株AY-VI2、AY-TB1、AY-VB2、AY-TB1VB2进行生长曲线的测定，结果见图4。从图4可以看出，重组菌株的生长速度和趋势与出发菌株相差不大，说明这些基因的过表达或敲除没有对酿酒酵母的生长造成明显影响。

图4 重组菌株生长曲线

2.2 重组菌株与出发菌株基本发酵性能的比较

将出发菌株和重组菌株进行液态酒精发酵实验，期间测定各菌株的CO2排放量，发酵结束后测定各菌株发酵液中酒精浓度和残余的还原糖含量，结果见表2。由表2可看出，重组菌株CO2排放量、酒精浓度和残余的还原糖含量与出发菌株基本相同，说明这些酿酒酵母重组菌株的基本发酵性能没有改变。

表2 各重组菌株与出发菌株基本发酵性能比较

2.3 重组菌株产乙偶姻及相关产物生成量的变化

出发菌株与各重组菌株产乙偶姻及相关产物的含量见表3。与出发菌株AY比较，过表达α-乙酰乳酸合成酶基因ILV2的重组菌株AY-VI2双乙酰含量提高了10.4%，而乙偶姻和2,3-丁二醇的生成量没有明显表化；乙偶姻还原酶基因BDH1缺失重组菌株AY-TB1双乙酰含量稍有提高，乙偶姻生成量提高了277.5%，2,3-丁二醇生成量降低了77.5%；双乙酰还原酶基因BDH2过表达重组菌株AY-VB2双乙酰含量下降了17.3%，乙偶姻生成量提高了75.5%，2,3-丁二醇生成量降低了19.2%；BDH1基因缺失且BDH2基因过表达重组菌株AYTB1VB2双乙酰含量下降了10.4%，乙偶姻生成量提高了390.9%，2,3-丁二醇生成量降低了72.9%。

综上所述，α-乙酰乳酸合成酶基因ILV2过表达可适量提高发酵液中双乙酰的含量，但对酿酒酵母乙偶姻的积累没有影响；乙偶姻还原酶基因BDH1缺失可大幅度减少酿酒酵母乙偶姻还原成2,3-丁二醇，从而显著提高乙偶姻的积累量；双乙酰还原酶基因BDH2过表达可加速双乙酰还原成乙偶姻，但乙偶姻的积累量没有BDH1缺失菌株显著；而BDH1基因缺失同时BDH2基因过表达重组菌株可进一步提高酿酒酵母乙偶姻的积累量。

表3 各重组菌株产乙偶姻及相关产物生成量的变化

2.4 重组菌株TTMP生成量的变化

出发菌株与各重组菌株合成四甲基吡嗪（TTMP）的含量见图5，从结果看，α-乙酰乳酸合成酶基因ILV2过表达对TTMP的合成无明显影响；乙偶姻还原酶基因BDH1缺失重组菌株AY-TB1和双乙酰还原酶基因BDH2过表达重组菌株AY-VB2的TTMP合成量比出发菌株分别提高了97.7%和37.0%；BDH1基因缺失且BDH2基因过表达重组菌株AY-TB1VB2的TTMP合成量最高，达10.80 mg/L，为出发菌株（AY）的2.72倍，由此可见，采用分子育种技术提高酿酒酵母发酵过程中乙偶姻的积累量，可有效提高白酒发酵过程中TTMP的合成量。

图5 出发菌株和重组菌株TTMP生成量

3 高产乙偶姻酿酒酵母菌株在清香型麸曲白酒中的应用

以出发菌株AY为对照，进行了高产乙偶姻酿酒酵母菌株AY-TB1和AY-TB1VB2清香型麸曲白酒固态发酵试验，其基本发酵条件为：500 mL发酵瓶，高粱原料100 g，稻壳添加量为高粱的20%，麸曲用量为8%，酵母细胞接种量为0.2亿/g高粱，糟配比1∶3.0，30℃发酵7 d。发酵结束后测定各菌株发酵酒醅总失重、酒精浓度、残余淀粉含量与乙偶姻、TTMP含量等数据，结果见表4和图6。

高产乙偶姻菌株酿酒酵母与出发菌株固态发酵基本性能比较见表4，结果表明，高产乙偶姻菌株的失重及发酵酒醅中酒精浓度和残余淀粉含量与出发菌株基本一致，其变化可以忽略，说明经重组后的高产乙偶姻菌株在固态发酵条件下的基本发酵性能没有发生明显变化。

表4 高产乙偶姻菌株与出发菌株固态发酵基本性能比较

高产乙偶姻酿酒酵母菌株与出发菌株固态发酵产乙偶姻和TTMP的情况如图6，结果表明，高产乙偶姻酿酒酵母菌株的乙偶姻生成量和TTMP合成量都有明显提高，其中菌株AY-TB1的乙偶姻和TTMP含量分别提高了262.65%和42.47%，菌株AY-TB1VB2的乙偶姻和TTMP含量分别提高了320.38%和74.66%。

图6 高产乙偶姻菌株酿酒酵母固态发酵乙偶姻和TTMP合成量

4 结论

（1）大量研究表明，白酒生产中的TTMP主要是由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等微生物代谢产生的前体物质乙偶姻，与氨的化学反应而形成的。由于芽孢杆菌大多为好氧菌种，进入发酵窖池后其生长和代谢很快停止，使其应用受到了很大的限制。只有将这两类菌种在发酵窖池外有氧发酵培养才能生成较高含量的TTMP，因而这种方法一般仅适合于具有窖外堆积培养过程的酱香型白酒和芝麻香型白酒等的生产。

（2）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在厌氧和耗氧条件下生长繁殖，且在厌氧条件下酒精发酵能力更强，同时具有耐酸的特点，它是各类发酵食品的主要功能菌。然而，普通的酿酒酵母不会积累较高的乙偶姻，最终在发酵食品中也不会合成较高TTMP含量。利用分子育种技术构建高产乙偶姻的酿酒酵母工业菌株，即可实现在酒精发酵的同时获得较高的TTMP产量。

（3）与酿酒酵母乙偶姻代谢相关的主要基因有α-乙酰乳酸合成酶基因ILV2、乙偶姻还原酶基因BDH1和双乙酰还原酶基因BDH2等。α-乙酰乳酸合成酶基因ILV2过表达对乙偶姻的积累和TTMP的合成无明显影响；乙偶姻还原酶基因BDH1缺失可大幅度减少酿酒酵母乙偶姻还原成2,3-丁二醇，从而显著提高乙偶姻的积累量和TTMP的合成量；双乙酰还原酶基因BDH2过表达可加速双乙酰还原成乙偶姻，但乙偶姻的积累量和TTMP的合成量的提高没有BDH1缺失菌株显著；而BDH1基因缺失同时BDH2基因过表达重组菌株可进一步提高酿酒酵母乙偶姻的积累量和TTMP的合成量。

（4）高产乙偶姻酿酒酵母菌株AY-TB1VB2在清香型麸曲白酒中的应用结果表明，与出发菌株比较，高产乙偶姻菌株在固态厌氧发酵条件下的基本发酵性能没有发生变化，酒醅中乙偶姻的含量提高达320.38%，TTMP的含量提高了74.66%。TTMP含量的提高幅度远少于乙偶姻积累量提高的幅度，可能的原因是发酵体系的温度较低和氨含量的不足，如何提高发酵酒醅中乙偶姻向TTMP转化的效率有待进一步研究。