沙门氏菌检测能力验证结果分析

◎ 朱 梦，杨穗珊，林宝英

（海南省食品检验检测中心，海南 海口 571700）

沙门氏菌广泛存在于自然界中，是一种常见的食源性致病菌，为革兰氏阴性杆菌，无荚膜和芽孢，属于肠杆菌科[1]。在中国，每年由沙门氏菌引起的食物中毒占所有细菌性食物中毒事件的70%～80%，由于沙门氏菌菌体溶解时，细胞壁能够释放出脂多糖，从而形成内毒素[2-3]，如果食用了污染了沙门氏菌的食物，就容易引起食物中毒，细菌会从肠道侵入血液而遍布全身，引起某些神经症状以及肝、肾和心脏病变或至死亡[4-5]。因此，在食品微生物检验检测工作中，对沙门氏菌的检测意义重大。

本实验室参加此次国家食品药品监督管理总局组织的能力考核，结合这几年微生物检验的经验，能够分析本次沙门氏菌能力验证试验中出现的问题，寻找出解决方案，为以后的检验检测工作提供必要的参考。

1 材料与方法

1.1 样品

3份考核样品，编号为CODE0375、CODE0770、CODE0766，每份样品为一块瓶装巧克力，装量约为10g，采用玻璃瓶包装。

1.2 培养基及试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、沙门氏菌显色培养基、三糖铁（TSI）琼脂、营养琼脂、Swarm琼脂、半固体培养基、沙门氏菌生化鉴定试剂盒（广州环凯生物科技有限公司）、VIDAS沙门氏菌（SLM）试剂条，VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡（法国梅里埃公司）、沙门氏菌阳性菌株鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）以及沙门氏菌属诊断血清（宁波天润生物药业有限公司，丹麦SSI公司）。

1.3 实验方法

按照考核方的作业指导书中的要求处理样品。样品处理好以后,依据GB 4789.4-2016《食品全国家标准 食品微生物学 沙门氏菌检验》[6]进行实验，得到疑似纯菌落后进行血清分型。全自动荧光免疫分析系统（MINI VIDAS）和全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2）作为实验辅助仪器进行筛选和鉴定，得出实验结果后报告。

1.3.1 样品的前处理

在生物安全柜内进行，需要准备90 mL预热至45 ℃的BPW：首先将灭菌的BPW加入检样瓶中，待巧克力融化后再加入无菌均质袋中。取20 mL灭菌的BPW清洗检样瓶，将洗液加入均质袋内，再取20 mL灭菌BPW重复清洗一次，最后向均质袋内加入30 mL灭菌BPW，充分均质混匀，制成1∶10稀释液。依此方法，分别对3件样品进行前处理。将编好号的BPW增菌液、阳性对照、空白对照一同放入36 ℃培养箱中18 h。

1.3.2 增菌培养

在10 mL TTB 和10 mL SC内，分别转接1 mL BPW培养物，并分别放入（42±1）℃培养箱和36 ℃培养箱中培养24 h。同时取0.5 mL灭活的BPW增菌液加入到沙门氏菌（SLM）试剂条中，按操作说明书进行操作。

1.3.3 选择性分离

将TTB、SC增菌液接种到XLD琼脂平板、BS琼脂平板和沙门显色培养基上，放入36 ℃培养箱中，BS琼脂平板培养48 h，XLD琼脂平板和沙门显色培养基培养24 h。培养结束后，观察平板上的菌落特征，判定有无可疑菌落生长。

1.3.4 生化鉴定实验

在每个平板上选取3个疑似菌落，接种于三糖铁（TSI）斜面上，同时接种到营养琼脂平板上进行纯化，36 ℃培养箱中培养24 h。将纯化后的菌落用沙门氏菌生化鉴定试剂盒和VITEK2鉴定。

1.3.5 血清学鉴定

先检查培养物是否有会自凝，在玻片上滴一滴生理盐水，将菌落涂在水滴中，等待30～60 s后，若出现菌体凝集，则有自凝性。没有自凝现象的菌落才做血清学鉴定。

（1）O抗原鉴定。O抗原可与相应抗体呈颗粒状反应。挑取一环待测菌涂在玻片的两个区域内，分别滴加A～F多价O血清和生理盐水各一滴，将混合液混匀等待1 min后，观察是否有凝集现象。被多价O血清凝集后，按照沙门氏菌属诊断血清说明书中的要求依次凝集OMA、OMB、OMC、OMD，来判定O群。随后继续做H抗原凝集实验。H抗原与对应抗体凝集后呈絮状，大多数沙门氏菌的H抗原有两相。如果遇到H相不凝集时，应该先恢复动力。如果恢复动力后还不能凝集，则需诱导后再做。

（2）动力恢复试验。取疑似菌落，接种到半固体琼脂上，取菌落最边缘的部分进行凝集试验。

（3）平板诱导法。加入1～2滴已凝集的诱导血清至Swarm培养基中，混合均匀，将待凝集菌株接种到板中央，36 ℃培养箱中培养12 h。挑取菌落最边缘的部位进行H相鉴定。

2 结果与分析

2.1 MINI VIDAS全自动荧光免疫分析结果

MINI VIDAS的检测结果为阳性对照鼠伤寒沙门 氏 菌（ATCC14208）、CODE0375、CODE0770、CODE0766均为沙门氏菌阳性（见表1）。

表1 MINI VIDAS检测结果表

2.2 增菌后选择性分离的结果

增菌划线分离后，平板观察结果，编号为CODE0375、CODE0770、CODE0766的培养基平板上均出现可疑菌落特征。各平板上菌落特征结果见表2。

表2 选择性培养基上的菌落特征表

2.3 生化实验和VITEK2鉴定结果

将纯化后的菌落进行生化实验和VITEK2鉴定，结果均与沙门氏菌属生化特性一致，详细结果见表3。

表3 生化实验和VITEK2鉴定结果表

2.4 血清分型结果

参照GB 4789.4-2016中血清学分型鉴定要求对CODE0375、CODE0770、CODE0766三个样品进行血清分型，结果见表4。

表4 血清分型结果表

3 结论与讨论

能力验证是保证实验室检测结果质量的一种必要手段。各个实验室参与能力验证，可了解承检实验室的检测能力，保证检测结果的准确性，从而提高各个实验室的检测水平，确保检测质量[7-8]。各个实验室通过参加能力验证，可以发现自身在检验工作中存在的问题，并进行改进和纠正[9]。

此次能力验证本实验室除了按照GB 4789.4-2016规定的方法鉴定以外，还运用了全自动荧光免疫分析结果（MINI VIDAS）作为辅助，对样品进行初筛。MINI VIDAS可以直接使用增菌液上机检测，避免人工检测过程中造成假阴性，可与传统方法相互补充，防止漏检[10]。在本次实验中，为了保证实验结果的准确性，采用了国产宁波天润和丹麦SSI公司两种品牌的血清相互验证[11]。沙门显色培养基对沙门氏菌属有很高的特异性，对沙门菌种的分离和判定都有很大的帮助，对一些与沙门氏菌很相似的变形杆菌都能够很直观地区分开[12-13]。

在整个实验的过程中，一定要注意对所有试剂进行验收，验收合格以后才能使用。按照GB4789.28-2013《食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》来进行验收[14]。目前食品微生物的检验方法有传统检验方法，免疫学法和分子生物学检测法三种。这三种方法各有优点，在检验工作中可相互补充和辅佐，以提高检验的准确性。