色素失禁症患者一家系NEMO基因序列检测分析3

路荣忠，许晓松，孙克涛

(1．淄博市中心医院，山东淄博 255031；2．山东百福基因科技有限公司，山东淄博 255000)

色素失禁症(incontinentia pigmenti，IP)是一种罕见的X连锁显性遗传性皮肤病，多见于女性，男性患儿通常在宫内死亡[1]。色素失禁症的临床症状主要表现为皮肤损害，而且伴有牙齿、神经系统和眼睛等病变[2]，该病在新生儿早期多以皮肤损害为首发症状。IP的主要致病基因为NF-κB必须调节蛋白(NF-κB-essential modulator，NEMO)，又称IKBKG基因。NEMO基因长度为23 kb，包含10个外显子和3个交替出现的非编码的第一外显子，共编码415个氨基酸。NEMO基因下游35.5 kb重复区域中存在一个高度同源的假基因ΔNEMO，序列排列方向与NEMO基因相反[3]。目前约80%的IP可找到基因突变，其中NEMO基因共有序列NEMO△4～10缺失可以导致60%～80%的IP[4]。本文对1个IP家系的NEMO序列进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 临床资料

1.1.1.1 先证者：女，2.5岁，早期红斑、水疱。现左右胸口处留有片状淡褐色不规则色素沉着，右腿留有旋涡状淡褐色色素沉着，左腿有典型水泡遗留色素沉着。眼失明，聋、哑，骨骼发育异常(不会走路、手不能握拳)，被诊断为IP。

1.1.1.2 先证者父亲：男，30岁，身体健康。

1.1.1.3 先证者母亲：女，27岁，视力：CF/30cm，生育二女，三胎怀孕4个月自然流产一男胎。

1.1.1.4 先证者姐姐：女，7岁，身体健康。

1.1.1.5 先证者外祖母：女，55岁，视力：双眼HM/10cm，贫血貌，其余正常，生育一女。

1.1.1.6 健康对照：女，36岁，身体健康，与该家系无血缘关系。

1.1.2 遗传家系图谱：见图1。根据临床资料绘制该家系的遗传家系图谱。

图1 遗传家系图谱

1.2 方法

1.2.1 DNA提取：经患者及家属、健康对照知情同意后，分别抽取所有成员外周静脉血2 ml于EDTA-K2抗凝管，采用全血基因组DNA提取试剂盒(百泰克公司)提取基因组DNA，-20℃保存。

1.2.2 目的片段扩增：参照文献[5]的方法，采用跨越断裂点方法鉴定NEMO和△NEMO基因特异性缺失，引物由北京中美泰和公司合成。

1.2.2.1 NEMO基因引物：上游：In2，5’-GAGGACCAATACCGAGCATC-3’，下游：JF3R，5’-CTCGGAGACACAGGAACCAGCA- 3’。

1.2.2.2 △NEMO基因引物：上游：Rev2，5’-GCCATCTGITFFFGCGTGTG-3’，下游：JF3R，5’-CTCGGAGACACAGGAACCAGCA-3’。引物In2，JF3R扩增片段长度为2.6kb，说明NEMO基因特异性缺失；引物Rev2，JF3R扩增片段长度为2.5kb，说明ΔNEMO基因特异性缺失[5]。未缺失者无法扩增出目的片段。原理见图2。

图2 特异性引物及扩增片段示意图

50 μl PCR反应体系如下：灭菌超纯水(UPW)17 μl，PCR Mix(百泰克公司)25 μl，上游引物(25 μmol/μl)1.5 μl，下游引物(25 μmol/μl)1.5 μl，模板DNA5 μl。

PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，NEMO基因60℃/△NEMO基因58℃复性1min，68℃延伸4 min，进行30个循环；68℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 PCR产物电泳：扩增后的产物于2 g/dl琼脂糖凝胶进行电泳，结束后用凝胶成像扫描仪(美国伯乐)观察目的条带并拍照保存。

1.2.4 PCR产物测序：对1.2.3所得三个扩增产物进行测序以确定突变位点，由北京中美泰和公司提供测序引物并完成测序。

1.2.5 血细胞检测：用日本SysMex XN-1000对所采血样进行血细胞检测。

2 结果

2.1 PCR产物电泳结果 见图3。

M：DNA Marker；A1，A2，A3，A4，A5，A6分别代表外祖母、父亲、母亲、姐姐、先证者及健康对照的NEMO基因扩增片段；B1，B2，B3，B4，B5，B6分别代表外祖母、父亲、母亲、姐姐、先证者及健康对照的△NEMO基因扩增片段。

图3 PCR产物凝胶电泳图

电泳结果显示先证者及其母亲、外祖母均能观测到引物In2，JF3R扩增的2.6kb大小的片段，其父亲、姐姐和健康对照未见该目的片段。所有家系成员及健康对照均未观测到引物Rev2，JF3R扩增的2.6 kb大小的片段。

2.2 PCR产物测序结果 对先证者及其外祖母、母亲的NEMO基因特异性缺失扩增产物进行测序，测序结果见图4。三人均未检测到断裂点Ⅰ，Ⅱ之间的序列(图2)，测序图中箭头所指位置的左侧为断裂点Ⅰ左侧的序列，右侧为断裂点Ⅱ右侧的序列，说明三人均有NEMO基因外显子4-10的缺失。

2.3 血细胞检测 所有家族成员及健康对照者白细胞计数及分类均未见明显异常，血细胞分析仪和涂片瑞氏染色也未发现嗜酸性粒细胞增多，仅有先证者外祖母的Hb为34 g/L，接近重度贫血。

S：NEMO基因断裂点附近的标准序列；A1，A3，A5分别代表外祖母、母亲、先证者的NEMO基因部分测序结果，箭头指示位置为断裂点。

3 讨论

色素失禁症最早于1906年由Garrod研究报道，是X染色体显性遗传病。女性有两个X染色体，杂合子患者由于X-染色体失活偏移可以存活，并表现出不同程度的表型症状；男性仅有一条X染色体，不存在X-染色体失活偏移，通常会在胎儿期死亡，存活的男性IP患者多为NEMO基因点突变导致[6]，还有几例为47-XXY性染色体异常型(Klinefelter综合征)或者存活男性为存在正常基因和NEMO△4-10缺失的嵌合体[6～8]。由于该症可导致智力发育迟缓、神经系统损害、眼睛、牙齿等发育异常，因此临床需提高对该病的认识。IP女性患者表型差异随个体变化很大，除造成皮肤损伤外，还会在皮肤附属物(脱发和指甲营养不良)、牙齿(个别牙缺失、小牙畸形、推迟生齿、锥形牙齿)、口腔(小颌畸形、凸颌、高腭)、中枢神经系统(癫痫、精神发育迟滞、头小畸型)、眼(视网膜脱离、色素性视网膜病变、晶状体后发育不良、斜视、白内障)和血液(嗜酸性粒细胞增多)等方面出现临床症状[2]。本文先证者已出现皮肤、眼和中枢神经系统等的损伤，其母亲和外祖母除眼睛视力障碍外尚未发现其他系统的损伤，血细胞常规检查也未发现明显异常，未见嗜酸性粒细胞增多。

本次研究应用Bardaro等[5]的方法，在NEMO基因内含子2和△NEMO基因外显子3的外侧设计上游引物，分别对NEMO基因或△NEMO基因特异性缺失进行鉴定，此方法已在其他研究中验证其准确度和实用性[3，7，10]。此次检测结果显示：先证者及其母亲和外祖母均存在NEMO基因4-10特异性缺失，其父亲、姐姐和健康对照者未见该缺失；所有家系成员及健康对照者均未检测到△NEMO缺失。先证者的NEMO基因4-10特异性缺失遗传自其母亲，检测结果符合该家系临床症状，NEMO基因外显子4-10缺失是先证者的致病基因突变。目前约80%的IP患者可以找到其致病基因，另外的20%尚未明确病因，所以对发现病例进行深入分析研究有重要意义。在已发现的可导致IP的基因突变中，NEMO基因共有序列 NEMO△4-10缺失占60%～80%[4]，10%为微缺失、点突变[9]。近年来已经证实NEMO基因为色素失禁症致病基因，将有助于解决该症诊断困难的难题。NEMO基因突变分析还可提供产前诊断技术，值得应用和推广。