高直链淀粉玉米和糯玉米籽粒发育过程中与淀粉合成相关酶活性的比较

张彦荣， 赵金涛， 郭新梅，2， 裴玉贺，2， 赵美爱， 宋希云，2

(1.青岛农业大学农学与植物保护学院，山东青岛 266109； 2.山东省青岛市主要农作物种质资源创新与应用重点试验室，山东青岛 266109；3.青岛农业大学生命科学学院/植物生物技术重点试验室，山东青岛 266109)

直链淀粉具有非常独特的利用价值，在轻工业、食品行业、制药业等30多个领域有着广阔的应用前景。普通玉米籽粒中直链淀粉含量少，提取成本高，因此，新型玉米——高直链淀粉玉米应运而生。高直链淀粉玉米胚乳中直链淀粉占总淀粉含量的50%以上，普通玉米中直链淀粉只占25%左右，而糯玉米中几乎不含直链淀粉。为了探究不同类型玉米中淀粉含量差异的原因，科学家们做了大量关于淀粉生物合成及积累方面的研究。

研究发现，多种酶[包括蔗糖合成酶(SS)[1]、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPPase)[2-4]、可溶性淀粉合成酶(SSS)[5]、束缚态淀粉合成酶(GBSS)[6-10]、淀粉分支酶(SBE)[11-12]、淀粉去分支酶(DBE)[13-14]等]参与了淀粉合成过程。关于各种酶在淀粉合成过程中发挥的作用，前人已做了较深入的研究，但是关于高直链淀粉玉米和糯玉米在籽粒发育过程中淀粉合成相关酶活性变化的研究却鲜有报道。由于糯玉米胚乳中几乎不含直链淀粉，而高直链淀粉玉米籽粒中直链淀粉含量高达50%以上，因此，在本研究中选取1个糯玉米自交系和3个高直链淀粉玉米自交系为材料，比较和分析2种玉米籽粒发育时期淀粉相关酶活性的变化，分析不同类型玉米之间直链淀粉含量差异的生理生化机制，为高直链淀粉玉米新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用的糯玉米自交系为黑478，选用的高直链玉米自交系为NS39、B19-1、B26-5，4种玉米中直链淀粉含量分别为2.6%、51.8%、60.7%、62.7%。2014年将试验材料种植于青岛农业大学现代科技示范园，常规田间管理。选生长发育一致的植株，开花期人工授粉。自授粉之日起，每5 d取果穗中部籽粒，液氮速冻后保存于-80 ℃备用，共取6次。

1.2 酶活性的测定

参照程方民等的方法[15]：取0.5 g籽粒鲜样加5 mL提取液[终浓度为：Hepes-NaOH(pH值7.5)50 mmol/L，KCl 2 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，PVP-30为10 g/L，DTT 1 mmol/L]，冰浴，磨成匀浆后取30 μL匀浆并加1.8 mL缓冲液，4 ℃、3 000 r/min 离心3 min，沉淀用缓冲液悬浮，用于GBSS活性的测定。其余匀浆4 ℃、13 000 r/min离心20 min，取上清液用于淀粉合成相关酶活性的测定。SS和ADPGPPase活性的测定参照Doehlert等的方法[16]。SSS、GBSS、SBE、DBE活性的测定参照Nakamura等的方法[17]。

2 结果与分析

2.1 4种玉米SS活性的变化

如图1所示，4种玉米SS活性在籽粒发育时期呈单峰变化趋势，授粉后20 d时SS活性达到峰值，而且4种玉米的峰值非常接近。授粉后15 d时，糯玉米黑478的SS活性比3种高直链玉米高，而在25～30 d时，黑478中SS活性低于高直链淀粉玉米。

2.2 4种玉米ADPGPPase活性的变化

如图2所示，在籽粒发育过程中，糯玉米和高直链淀粉玉米中ADPGPPase的活性随着籽粒成熟时间不断升高。授粉后20～35 d，ADPGPPase的活性较稳定，高直链玉米中ADPGPPase的活性显著高于糯玉米黑478(P<0.05)，表明在籽粒灌浆后期，高直链玉米具有更高的ADPG供应水平。

2.3 4种玉米SSS活性的变化

在玉米胚乳细胞中，SSS主要负责催化合成支链淀粉。如图3所示，本试验中糯玉米和高直链淀粉玉米SSS活性的变化趋势相同，均为单峰曲线，不同的是，糯玉米黑478在授粉后20 d时达到峰值，而3种高直链玉米均在授粉后25 d时达到峰值。此外还发现，授粉15 d后，糯玉米黑478中SSS的活性一直高于3种高直链淀粉玉米。较低的SSS活性可能是高直链淀粉玉米中支链淀粉比例较少的影响因素之一。

2.4 4种玉米GBSS活性的变化

如图4所示，GBSS活性在4个玉米自交系中均表现为先上升后下降的趋势。相比之下，糯玉米黑478更早达到峰值，GBSS活性在授粉后20 d时达到最大，而3个高直链淀粉玉米自交系中GBSS活性在授粉后25 d时达到最大值。高直链淀粉玉米GBSS活性在授粉25～35 d时明显高于糯玉米黑478，表明高直链淀粉玉米在籽粒灌浆后期具有更强的直链淀粉合成能力。

2.5 4种玉米SBE活性的变化

如图5所示，不同玉米中SBE活性均呈先上升后下降的变化趋势。糯玉米黑478的SBE活性在授粉后20 d时达到最大值，3种高直链淀粉玉米中SBE在授粉后25 d达到最大值，而且几乎在整个籽粒发育时期，黑478的SBE活性均高于3种高直链淀粉玉米。在淀粉合成过程中，SBE能催化使淀粉含有α-1，6糖苷键链接的支链，一方面，这能使葡聚糖的分子量不断增大，以便细胞容纳更多的具有能量的物质；另一方面，α-1，6糖苷键的导入使葡聚糖的非还原性末端增加，这有利于淀粉合成酶的催化反应，使它们能在短时间内催化合成更多的淀粉。

2.6 4种玉米DBE活性的变化

如图6所示，4种玉米自交系籽粒发育时期DBE活性的变化趋势相似，在授粉后5～30 d DBE活性逐渐上升，并且在30 d时达到最大，在30～35 d时DBE活性快速下降。此外，糯玉米黑478中DBE的活性在每个时期都高于3种高直链淀粉玉米。DBE在淀粉合成时主要负责对支链淀粉的修饰，因此，黑478中支链淀粉含量多可能是导致籽粒发育过程中DBE活性较高的原因。

3 讨论与结论

玉米籽粒中70%以上的成分是淀粉，其中直链淀粉是由α-1，4糖苷键连接α-D-葡萄糖而形成的链状分子，分子量约为105～106[18]。支链淀粉分子量比直链淀粉大，大约由600～6 000个葡萄糖残基构成，在支链淀粉中，葡萄糖残基除了以α-1，4糖苷键相连，还有以α-1，6糖苷键相连的分支。

玉米籽粒发育过程中淀粉的合成及积累是一个非常复杂的过程，包括多种碳水化合物的相互转化，并且多种酶参与了这一过程。张海艳等报道，淀粉积累是蔗糖降解的结果，SS主要负责籽粒中蔗糖的降解，因此在蔗糖向淀粉的转化过程中起重要作用[19]。本试验中，糯玉米黑478在授粉后 15 d 时，籽粒中SS的活性比高直链淀粉玉米中高，在授粉后25～30 d时籽粒中SS的活性比高直链淀粉玉米中低，由此推测，相比糯玉米，高直链淀粉玉米在籽粒发育后期蔗糖分解旺盛，更有利于胚乳中淀粉的积累。

ADPGPPase的主要功能是催化淀粉合成时葡萄糖的供体ADPG的形成[16]，被普遍认为是淀粉生物合成过程中的限速酶。但是，目前的研究对于ADPGPPase与淀粉合成之间关系的论述并不统一。部分研究表明，ADPGPPase的变化与淀粉含量之间呈正相关[2-3]，而另有研究表明，ADPGPPase活性的变化只能影响ADPG含量的变化，与最终淀粉含量的多少并无显著关联[19-20]。本试验中，高直链淀粉玉米中ADPGPPase活性在大部分时期均显著高于糯玉米，但是3种高直链淀粉玉米成熟籽粒的百粒质量却低于糯玉米黑478，因此，ADPGPPase活性的变化可能与籽粒中淀粉的合成并无简单直接的相关性，籽粒中用于淀粉合成的葡萄糖可能有多种供应途径，并不单一依赖于ADPG的转化。

SSS是催化淀粉合成的关键酶之一，同时也是催化支链淀粉合成的重要酶之一[21]。本试验中，在授粉5～15 d时，4种玉米自交系中SSS的活性没有明显差异，在授粉后15～35 d 时，糯玉米黑478中SSS的活性明显高于3种高直链淀粉玉米。高直链淀粉玉米中SSS活性较低可能是导致支链淀粉含量较少的原因之一。

GBSS对直链淀粉的合成起重要作用。本试验中，GBSS的活性在糯玉米和高直链淀粉玉米中的差异主要出现在籽粒发育后期，在授粉后25～35 d时，3种高直链淀粉玉米中GBSS的活性均高于糯玉米黑478，说明高直链淀粉玉米在籽粒发育过程中直链淀粉的合成能力更强。刘霞等报道，籽粒灌浆中后期的GBSS活性对直链淀粉最终积累量的调节作用大于前期[22]，这也与此研究结果一致。

在植物淀粉合成过程中，SBE是唯一能引入α-1，6糖苷键而引起淀粉分支的酶，因此，其活性对支链淀粉的含量及精细结构的影响非常重大。柴晓杰等应用反义RNA和RNAi技术，抑制了玉米淀粉分支酶同工酶基因的表达，使支链淀粉的合成降低，直链淀粉的含量约提高50%[23]。本试验中，在籽粒发育大部分时期糯玉米黑478 SBE的活性均高于3种高直链淀粉玉米，说明SBE活性与支链淀粉的积累紧密相关，这与前人的研究结果[11]是一致的。

有研究表明，玉米和水稻的Sugary-1突变体(缺失DBE活性)胚乳中水溶性多糖和植物糖原积累增多，支链淀粉积累减少，支链淀粉精细结构发生变化，导致淀粉的形态学和理化特性也发生了变化[13-14]。本试验中，DBE在糯玉米黑478中的活性几乎在整个籽粒发育时期都高于3种高直链淀粉玉米，这表明DBE活性似乎对支链淀粉的积累具有积极意义，结合前人的研究推测，DBE的作用可能主要是参与支链淀粉精细结构的修饰，其对于淀粉积累的作用还有待于更深入的研究。

通过比较分析糯玉米和高直链淀粉玉米在籽粒发育时期淀粉合成相关酶活性的变化，本研究认为，SSS、GBSS、SBE等3种酶的活性是影响玉米籽粒直链淀粉含量或积累的重要影响因素，高直链淀粉玉米籽粒中直链淀粉含量高是上述3种酶综合作用的结果。SS和ADPGPPase在淀粉合成过程中的主要作用是为淀粉合成提供底物，这2种酶的活性对籽粒最终总淀粉含量有一定影响。DBE在淀粉合成中的主要作用可能是对支链淀粉精细结构的修饰，与直链淀粉的积累没有直接关系。由于本研究中只选取了1个糯玉米自交系及3个高直链淀粉玉米自交系，因此，试验结果在高直链淀粉玉米和糯玉米中是否普遍适用还有待于进一步的探讨。