鸡粪沼液对果树5种病原菌的抑菌杀菌作用

王洪涛， 王英姿， 石 洁， 董泰丽， 付传翠

(1.山东省烟台市农业科学研究院植物保护研究所，山东烟台 265500； 2.山东民和生物科技股份有限公司，山东蓬莱 265600)

进入21世纪以来，我国面临着能源短缺和环境污染的两大问题。沼气工程具有可以产生替代能源和减少环境污染的优势，近年来规模化沼气工程建设在国内外得到了迅速发展[1-3]。沼液是沼气生产的重要副产品，是一种养分含量全面、速效养分丰富、肥效稳定的有机肥。将其有效利用，不仅可以带来可观的经济效益，而且具有显著的社会效益[4]。国内外许多学者对沼液的综合利用进行了很多研究，主要集中于沼液作为有机肥在农业生态中的应用，包括对农产品质量、品质的影响，对土壤理化性质的影响，对环境的安全评价等[5-7]。

沼液除了具有肥力特性外，还具有抑菌、抗逆、杀死和抑制作物病虫的作用，是理想的化学农药代替品[8]。前人关于沼液施用对作物病害防治的作用开展了大量研究，主要集中于水稻、小麦、玉米、棉花、烟草、甘薯、番茄、辣椒、黄瓜、茄、草莓等作物上。已有研究表明，沼液对某些植物病原真菌具有显著抑制作用[9-10]，但关于鸡粪沼液对果树类病原菌抑制作用的研究还未见报道。本研究选择对果树(苹果、葡萄)有较大影响的5种主要病原菌(苹果轮纹病病菌、苹果斑点落叶病病菌、葡萄灰霉病病菌、葡萄白腐病病菌、葡萄炭疽病病菌)进行鸡粪沼液抑菌和杀菌试验，分别研究不同浓度的鸡粪沼液对这5种病原真菌的抑制效果和灭杀作用，旨在为进一步研究鸡粪沼液抑制病原菌机制提供理论基础，同时也为鸡粪沼液应用于果树病害的田间防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 沼液 沼液由山东民和生物科技股份有限公司提供，主要发酵原料为鸡粪。

1.1.2 菌种 苹果轮纹病病菌(Botryosphaeriadothidea)、苹果斑点落叶病病菌(Alternariamali)、葡萄白腐病病菌(Coniothyriumdiplodiella)、葡萄炭疽病病菌(Glomerellacingulata)、葡萄灰霉病病菌(Botrytiscinerea)由山东省烟台市农业科学研究院植物保护研究所提供。

1.1.3 培养基 上述5种病菌菌试验均采用马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，简称PDA)培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 试验前的准备 鸡粪沼液浓度梯度的设定：将鸡粪沼液用无菌水稀释成5、10、25、50、100、300倍液6个浓度梯度，备用。

供试病原菌的培养：将已接种供试菌的PDA培养基平皿放入恒温箱培养4～5 d，备用。

1.2.2 抑菌试验操作 将培养基经121 ℃灭菌20 min，自然冷却至温度为30～40 ℃时，按照每100 mL PDA培养基中添加5 mL的比例，分别向盛有培养基的三角烧瓶中加入不同浓度的鸡粪沼液，以无菌水作为对照，混合均匀后倒入平皿中。待平皿中培养基凝固后，在无菌条件下，用灭过菌的内径为 6 mm 的打孔器取相同大小的菌饼。将菌饼移至不同培养基平皿中央，菌丝面朝下(菌丝面与培养基接触)，每个培养皿内放置1个菌饼。将接菌后的培养皿置于生化培养箱内，在温度为27 ℃的条件下培养。共培养7 d，每隔24 h用游标卡尺十字交叉法垂直测量培养基平皿上病原菌菌落的直径，取其平均值，单位为mm，记数。每个处理5次重复。

1.2.3 杀菌试验操作 在无菌条件下，用灭过菌的内径为 6 mm 的打孔器将完全被抑制的菌块(鸡粪沼液5倍液处理)移至空白PDA培养基平皿中央。将平皿放入恒温箱中培养，每隔24 h测量培养基平皿中病原菌菌落的直径，记数，共培养 7 d。每个处理5次重复。

1.2.4 抑(杀)菌率计算公式 根据调查数据，按下面公式计算抑(杀)菌率：

1.3 数据分析

数据采用Excel、SPSS 18.0分析软件进行方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鸡粪沼液对葡萄灰霉病病菌的抑制效果

由表1可知，鸡粪沼液对葡萄灰霉病病原菌生长抑制作用明显，且与其浓度呈正相关。试验期间，5、10倍液鸡粪沼液处理对葡萄灰霉病病菌抑制率均为100.00%。处理1 d后，25、50、100倍液鸡粪沼液处理对葡萄灰霉病病菌抑制率分别为100.00%、100.00%、91.67%；随着处理时间的延长，其抑菌效果略有下降，7 d后抑菌率分别为92.62%、83.07%、61.46%。300倍液鸡粪沼液处理对葡萄灰霉病病菌抑制率较差，至试验结束时抑菌率仅为11.33%。

2.2 鸡粪沼液对葡萄白腐病的抑制效果

由表2可知，沼液浓度不同，其对葡萄白腐病的抑制作用有一定差异。5、10倍液鸡粪沼液处理对葡萄白腐病病菌抑制率均为100.00%。处理1 d后，25、50、100倍液鸡粪沼液处理对葡萄白腐病菌抑制率分别为100.00%、100.00%、89.29%；随着处理时间的延长，其抑菌效果略有下降，试验结束时抑菌率分别为90.68%、85.04%、58.35%。处理后7 d，300倍液鸡粪沼液处理对葡萄白腐病病抑菌率仅为13.66%，抑制效果较差。

表1 鸡粪沼液对葡萄灰霉病病原菌生长的抑制作用

表2 鸡粪沼液对葡萄白腐病病原菌生长的抑制作用

2.3 鸡粪沼液对葡萄炭疽病的抑制效果

由表3可知，鸡粪沼液对葡萄炭疽病病菌抑菌作用差异明显，且与其浓度密切相关。其中，5、10倍液鸡粪沼液处理抑菌作用最为明显，试验结束时对葡萄炭疽病病原菌生长的抑制率分别为100.00%、78.15%，其他4个处理对葡萄炭疽病病菌抑菌率均在29.00%以下，抑菌效果不显著。

表3 鸡粪沼液对葡萄炭疽病病原菌生长的抑制作用

2.4 鸡粪沼液对苹果轮纹病的抑制效果

由表4可知，鸡粪沼液对苹果轮纹病病菌抑菌作用随着沼液浓度的降低而逐渐减弱。其中，5、10倍液鸡粪沼液处理抑菌作用最为明显，试验停止时对苹果轮纹病病原菌生长的抑制率分别为100.00%、86.78%，其他4个处理对苹果轮纹病病菌抑菌率均在26.00%以下，抑制作用不明显或无抑制作用。

2.5 鸡粪沼液对苹果斑点落叶病的抑制效果

由表5可知，不同浓度的鸡粪沼液对苹果斑点落叶病病原菌生长表现出不同程度的抑制作用。其中，5倍鸡粪沼液稀释液处理抑菌作用最为明显，抑菌率均为100.00%；处理 7 d 后， 10、25、50 倍液鸡粪沼液稀释液 3个处理抑菌率均在46%以下，抑制效果不明显；100、300倍液鸡粪沼液稀释液2个处理对苹果斑点落叶病病菌抑菌率为负值，说明这2个处理对苹果斑点落叶病没有抑制作用。

表4 鸡粪沼液对苹果轮纹病病原菌生长的抑制作用

表5 鸡粪沼液对苹果斑点落叶病病原菌生长的抑制作用

2.6 鸡粪沼液对5种果树病原菌的灭杀作用

病原菌不同，鸡粪沼液对其灭杀作用存在差异。由表6可知，鸡粪沼液稀释5倍后对葡萄灰霉病病菌、苹果轮纹病病菌、苹果斑点落叶病病菌的生长都表现出极强的灭杀作用，7 d 试验中，灭菌率均为100.00%，但对葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌灭杀作用稍差。处理1、2 d后，其对葡萄炭疽病病菌灭杀率均为100.00%，对葡萄白腐病病菌灭杀率分别为63.70%、44.09%，随着处理时间的延长，其灭菌效果逐渐减弱。至7 d时，鸡粪沼液5倍稀释液对葡萄炭疽病病菌和葡萄白腐病病菌灭菌率分别为45.29%、30.35%。

表6 鸡粪沼液对5种果树病原菌生长的灭杀作用

注：表中数据为平均数±标准误；同列数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

3 讨论

沼液对许多植物病原真菌具有明显的生长抑制作用[8，10-12]，但相关研究主要集中在以猪粪、牛粪为发酵原料的沼液上。由于沼液的成分受发酵原料、沼气工程等工艺等因素的影响，不同沼液的理化及生物学性状有很大差异，因此沼液对植物病害的防治效果并不完全一致[13]。

本研究以5种常见果树病原菌为防治对象，分析以鸡粪为发酵原料的沼液对这5种病原菌生长的抑制效果和灭杀作用。试验结果表明，鸡粪沼液对这5种病原菌的抑制效果与其浓度有关。鸡粪沼液稀释5倍后，均能完全抑制各种病原菌的生长。随着沼液浓度的降低，其抑菌作用逐渐减弱。在同一浓度下，鸡粪沼液对葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有明显的抑制作用，但对葡萄炭疽病、苹果轮纹病和苹果斑点落叶病的抑制效果较弱，说明同一沼液对不同病原菌的抑制作用存在差异，这与马艳等的研究结论[14-15]一致。随着处理时间的延长，鸡粪沼液对5种果树病原菌的抑菌作用逐渐减弱，这与尚斌等研究结果[13]矛盾，这可能与沼液发酵原料和病原菌种类不同有关。国内关于沼液在植物病害防治上的应用已有诸多报道，但主要集中在沼液对植物病原菌生长的抑制作用，并未对其杀菌作用进行深入研究。鸡粪沼液对5种果树病原菌杀菌试验结果表明，鸡粪沼液对葡萄灰霉病病菌、苹果轮纹病病菌、苹果斑点落叶病病菌的生长均表现出极强的灭杀作用，灭菌率均为100%，但对葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌灭杀作用稍差，这说明鸡粪沼液对不同病原菌的灭菌效果有所不同。

葡萄灰霉病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病、苹果轮纹病、苹果斑点落叶病是葡萄、苹果等果树生产中的重要病害[16-19]，对产量和品质影响极大[20-22]。目前对上述病害的防治仍以化学防治为主，但由于用药不科学，多年持续使用单一药剂，造成病原菌对一些杀菌剂已产生了不同程度的抗药性[23-26]。因此，亟须应用无公害技术防治上述病害。沼液因无污染、无残留、无抗药性而被人们称为“生物农药”，其用于植物病虫害防治的研究已成为近年来的研究热点。已有研究结果表明，用沼液替代化肥和农药，可减少20%以上的化肥和农药施用量，并显著降低某些病害的发生率[9]。本试验所用鸡粪沼液已经商业化生产，具有生产全流程自控、产品全生态性、沼液养分稳定等工艺优势，克服了传统沼液对病害防治效果不稳定、重复性差的缺点。鸡粪沼液稀释50倍后对葡萄灰霉病、葡萄白腐病的抑制效果仍在80%以上，作为生物制剂其抑菌效果与部分化学农药相当，下一步将在田间验证其对果树病害的防治效果，并探索鸡粪沼液与化学农药混和使用在果树病害防治方面的可行性。

目前关于沼液抑菌防病效果的研究仍处于探索阶段，本试验在室内研究鸡粪沼液对5种果树病原菌菌丝生长的抑制作用和灭杀效果，下一步将深入研究其对病原菌产孢和分生孢子萌发的影响。鸡粪沼液对病原菌的抑制作用与其浓度密切相关，今后将进一步分析沼液中主要抑菌、灭菌成分，更好地了解鸡粪沼液抗病作用机制。

鸡粪沼液对病原菌生长的抑制作用具有选择性，且与其浓度呈正相关。鸡粪沼液对葡萄灰霉病和葡萄白腐病具有强烈的抑制作用，但对葡萄炭疽病、苹果轮纹病和苹果斑点落叶病的抑制作用不明显；随着鸡粪沼液浓度的降低，其对病原菌的抑制作用逐渐减弱。鸡粪沼液对不同病原菌的灭杀效果存在差异，鸡粪沼液稀释5倍后能够完全灭杀葡萄灰霉病病菌、苹果轮纹病病菌、苹果斑点落叶病病菌，但对葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌灭杀作用稍差。在田间对葡萄灰霉病、葡萄白腐病的防治推荐使用鸡粪沼液50倍液，对其他3种病害的防治建议使用鸡粪沼液10倍液。鸡粪沼液对同一种病原菌的抑制作用和灭杀活性是不同的。鸡粪沼液能够完全抑制葡萄炭疽病病菌、葡萄白腐病病菌的生长，但并不能将这2种病原菌全部杀死。研究结果可为鸡粪沼液用于果树病害环境友好型杀菌剂的进一步研究开发提供科学参考。