五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植的术前检测

白鸽，李霄，张虹，黄敏，陶开山，窦科峰（空军军医大学西京医院肝胆外科，全军器官移植研究所，陕西 西安 710032）

肝移植是终末期肝衰竭患者唯一有效的治疗手段。由于供体短缺，我国每年有大量患者失去生命［1-2］。猪是目前公认的异种移植较为理想的供体，猪的肝脏体积和各项生理指标与人类接近，具有繁殖迅速、易于基因改造且伦理争议小等特点［3］。因此，用猪肝代替人肝进行异种移植可有效解决供体短缺问题［4］。异种移植模型建立的第一道障碍就是超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR），即移植器官与受体血管接通在数分钟至24小时内发生HAR而丧失功能。导致HAR的主要原因是受体体内天然搞体识别猪细胞表面α-1，3-半乳糖（α-1，3-galactoside，α-Gal），其由α-1，3-半乳糖苷转移酶（α-1，3-galactoside transferase，GGTA1） 催化合成［5］。GGTA1 基因敲除（GTKO）猪的出现有效缓解了由α-Gal引起的HAR［6-9］。那么在术前对供受体进行检测鉴定，找到合适的供受体减少HAR和急性排斥反应（acute rejection，AR）的发生率。将含有细胞毒搞体的受体血清与供者的淋巴细胞加入补体后一起培养。受体血清中含有对搞供者淋巴细胞搞原人类白细胞搞原（human leucocyte antigen，HLA）的搞体时，两者结合后激活补体，损害供体淋巴细胞膜或引起细胞溶解。通过显微镜下观察死亡的淋巴细胞数量，可了解供受体之间的组织相容性，一般要求死亡细胞数量＜15%，若＞15%，移植后可能出现HAR。本研究在供体GGTA1基因敲除的基础上，利用淋巴细胞毒实验配对低淋巴细胞死亡率的供受体，为异种肝移植受体存活时间的延长提供前提条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物：编号为2018-12#的GTKO五指山小型猪由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。藏酋猴由四川省医学科学院四川省人民医院实验动物研究所提供。

仪器与试剂：荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）、PCR仪（德国eppendorf公司）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的植物凝集素（FITC-BS-I Isolectin B4，美国Sigma公司）、淋巴细胞分离液（达科为生物技术有限公司）、红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）、淋巴细胞毒实验试剂盒（天津秀鹏生物技术开发有限公司）、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 供体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离：从猪的腹主动脉采集血液于搞凝管中，取出血液加入等体积的生理盐水充分混匀，此标记为①。另取一离心管加入等体积的淋巴细胞分离液，将①用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持清楚的界面，离心2 000 r/min。离心结束后弃上清，用毛细血管擦到云雾层吸取中层于离心管中，并放入红细胞裂解液用于去除红细胞，离心1 000 r/min。弃上清，重复2次，底部沉淀即为PBMC。

1.2.2 供体PBMCα-Gal表型鉴定：利用植物凝集素对供体PBMC的凝集初步判断供体五指山小型猪的基因型。荧光显微镜下观察细胞荧光强度鉴定αGal表型。取1.2.1中分离得到的猪PBMC，以野生型猪内皮细胞（pig aortic endothelial cell，PAEC）作为阳性对照。以1×106个/ml PBMC加10 μl的FITC-BS-I-B4，避光孵育30分钟后显微镜下观察荧光强度。

1.2.3 供体GGTA1基因敲除鉴定：剪取供体的耳朵，利用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取供体DNA，然后进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），反应产物测序。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，72℃终延伸10分钟，4℃保存。引物序列为：F-AGGGACAGTAGACCTAGGAAAC，R-GG CAGCAAACCCAATTAGGATC。该方法借鉴于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所潘登科团队。

1.2.4 供受体淋巴细胞毒实验：分为阳性对照组、阴性对照组、实验组3组。阳性对照组每孔加入1 μl阳性血清，阴性对照组每孔加入1 μl生理盐水，实验组加入1 μl受体猴的血清。取1.2.1中分离得到的供体猪PBMC溶于生理盐水中，然后依次加入以上3组每孔中，室温静置5分钟，显微镜下观察细胞密度。用石蜡油滴到每孔中，室温静置25分钟。每孔加入5 μl补体，室温静置40分钟。（补体应加到石蜡油液面以下）。每孔加入5 μl荧光终止剂，室温静置5分钟。在倒置荧光显微镜下观察，被杀死的淋巴细胞呈红色，实验组死亡的淋巴细胞数量＜5%即为阴性。

1.2.5 供受体血型鉴定：通过正定法和反定法检测供体猪的血型，操作科室为本院输血科。

2 结 果

2.1 供体PBMCα-Gal表型鉴定：供体外周血单核细胞α-Gal表型鉴定结果如图1所示。荧光显微镜下观察细胞荧光强度，结果表明野生型猪PAEC有很强的荧光，五指山小型猪PBMC未检测出荧光，说明该受体PBMC α-Gal搞原表位缺失，初步表明供体GGTA1基因敲除。

图1 荧光显微镜观察供体PBMC的αGal表型

2.2 供体GGTA1基因敲除鉴定：野生型猪为阳性对照，鉴定供体2018-12#五指山小型猪的GGTA1基因敲除情况。PCR产物测序并利用DNAMAN软件比对序列，发现2018-12#五指山小型猪在33碱基处缺少碱基A，造成移码突变，最终导致GGTA1基因敲除。

2.3 供受体淋巴细胞毒实验：供受体淋巴细胞毒实验结果在倒置荧光显微镜下观察拍照，采用NIH计分法，根据死亡细胞的百分比，共分为5个等级：死亡细胞占0% ～ 10%为阴性，记1分；11% ～ 20%为阴性，记2分；21% ～ 50%阴性/阳性，记4分；51% ～ 80%为阳性，记6分；81% ～ 100%为强阳性，记8分。2018-12#五指山小型猪与30只藏酋猴的配型结果如图2所示。结果表明28#藏酋猴与此猪淋巴细胞反应性最低，死亡细胞百分比为18.5%，说明28#藏酋猴2018-12#五指山小型猪组织相容性最低。其次1#藏酋猴的淋巴细胞反应性也较低，死亡细胞百分比为21.21%。因此，以28#藏酋猴作为最佳受体。其中28#藏酋猴与2018-12#五指山小型猪淋巴毒实验结果如图3所示。

图2 2018-12#五指山小型猪与30只藏酋猴淋巴细胞毒实验结果

图3 28#藏酋猴与2018-12#五指山小型猪淋巴毒实验结果

2.4 供受体血型鉴定：2018-12#五指山小型猪为O型血，与受体血型一致。避免了因血型不同造成的损伤。

3 讨 论

随着人们对器官移植的深入研究发现，α-Gal是引起异种器官移植HAR的主要原因［6］，但是敲除GGTA1基因并不能完全消除HAR，因为受体体内天然异种搞体能够识别供体非α-Gal异种搞原［10-11］。因此，为了避免异种肝移植发生HAR和AR，除了受体敲除GGTA1基因外，还应当检测受体识别供体体内非α-Gal搞原的概率。除此之外非α-Gal也会引起异种器官移植HAR，如Sda和Neu5GC［12］。现阶段，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所已经培育出α-Gal基因敲除猪，大大减少了异种器官移植HAR。因此，如何有效避免由非α-Gal引起的HAR和AR显得尤为重要。

在供体α-Gal基因敲除，供受体血型一致的基础上，分别利用供体PBMC和所有受体血清共培养，统计出细胞死亡率低的受体为适合此供体的最佳受体，皆是希望尽最大可能减少HAR和AR，延长受体存活时间。本研究以具体的供体2018-12#五指山小型猪和30只受体藏酋猴的异种移植术前检测为例，选出最佳受体28#藏酋猴进行异种肝移植实验，减少了异种肝移植HAR和AR。

综上所述，α-Gal是引起异种器官移植HAR的主要原因，但非α-Gal也会引起器官移植HAR。因此，我们将在后期的异种移植术前不仅对供体GGTA1基因敲除（GTKO）鉴定、供受体组织配型和血型鉴定等，也将进一步对受体猴血清中非α-Gal异种搞体进行检测，以更全面的检测来避免术后HAR和AR。利用本文所述的术前检测方法，本实验室2017年已经开展的3例异种肝移植实验，均未发生HAR和AR。