重组人促红细胞生成素预处理减轻大鼠肝脏缺血/再灌注损伤

慕喜喜，李静，韩璐，钟岳，何大立，窦科峰，陶开山（. 空军军医大学西京医院肝胆外科，陕西 西安 700；.西安市中心医院神经外科，陕西 西安 7000；. 西安市中心医院超声科，陕西 西安 7000）

缺血/再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是临床常见的肝损伤因素之一，通常发生在肝切除、肝移植、外伤和低血容量休克的过程中，病理特点主要是由库普弗（Kupffer）细胞、淋巴细胞及中性粒细胞的活化引起组织细胞受损，同时钙超载、氧自由基及细胞因子的释放和活化引起炎症反应、细胞坏死及凋亡。肝脏IRI的病理生理过程十分复杂，其分子机制目前仍未完全阐明［1］。因此，积极采取有效措施减轻肝脏IRI造成的不利影响对于促进肝切除后肝功能恢复，降低肝移植术后排斥反应等具有重要意义。红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由肾脏产生的一种糖蛋白细胞因子，在过去的几十年里，EPO由于其促进红细胞生成的能力而被广泛应用于临床［2］。近年来，许多研究表明，EPO具有炎性转录因子调控活性，在肾脏和心脏的缺血/再灌注过程中能起到一定的保护作用［3-4］。然而，EPO 对肝脏 IRI的意义目前未知。因此，本研究将观察重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）预处理对肝脏IRI的影响，并探索其可能的机制，为临床肝脏IRI的预防提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物：健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只购于北京华阜康生物科技股份有限公司，约6～8周龄，体重200～250 g，饲养于清洁环境中。

1.2 主要试剂：rhEPO（德国NeoRecormon，Roche公司）；大鼠肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素（interleukin）IL-6和IL-1β的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；蛋白免疫印迹试验（Western Blot） 检 测 搞 体 ：anti-p-p85（1：1000，英 国Abcam公司），anti-p85（1：500，英国Abcam公司），anti- p-AKT（1：500，美国 CST公司），AKT（1：1000，美国CST公司），β-actin（1：300，英国Abmart公司），HRP标记的二搞（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript RT Master Mix试剂盒（日本Takara公司）；BCA蛋白检测试剂盒（上碧云天生物技术有限公司）。

1.3 实验分组及模型建立：经过约1周时间的环境适应后，随机均分为3组，分别设立实验组、对照组和假手术组。在肝脏IRI模型建立前1小时，实验组使用5 000 U/kg的rhEPO进行尾静脉注射，而对照组和假手术组，则分别注射生理盐水。rhEPO的给药剂量参考前期相关研究［5］。大鼠70%肝脏IRI模型：术前禁食，在环境温度25℃下，使用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后采取平卧位，纵行切口打开腹腔，应用显微血管夹夹闭肝左、肝中叶脉管的共干，使得肝左叶及肝中叶缺血，以实现70%的肝脏组织缺血，阻断血流1小时后恢复肝脏血供3小时，然后处死大鼠，留取血样和肝脏标本。所有的动物实验均通过了医院伦理委员会批准（20171102）。

1.4 肝组织病理学检查：取大鼠肝脏缺血/再灌注后的肝脏标本，置于中性甲醛中固定，固定时间为24小时，取适量肝组织标本经浓度梯度酒精脱水后石蜡包埋，将石蜡包埋后的组织制作成石錯切片。将切片先经脱蜡水化，然后分别采用苏木素/伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，最后脱水透明处理，进行中性树脂封片，显微镜下观察结果并评价损伤情况［6］。

1.5 血清学检测：用促凝管收集实验鼠的血液，分离血清，送至本院检验科，使用全自动生化仪检测天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的释放情况。并用ELISA试剂盒，按照使用说明书，检测血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白的表达量。

1.6 实时定量PCR检测：按说明用Trizol提取肝组织总RNA，取4 mg总RNA，使用Prime Script RT Master Mix反转录成cDNA，用ABI 7500 system进行实时扩增。扩增条件：95℃30秒，95℃5秒40个循环，60℃34秒，最后95℃15秒。内参选择 β-actin，使用2-ΔΔCt的方法计算相对表达量。

1.7 Western Blot检测：用1×蛋白上样缓冲液，在冰上裂解细胞（加入蛋白酶抑制剂），提取蛋白99℃变性10分钟。然后用BCA蛋白检测试剂盒，检测提取蛋白浓度。制作10%的SDS-PAGE分离胶，蛋白上样后电泳，110 V，120分钟。转膜，220 mA，40分钟。5%牛奶封闭后，加入一搞4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二搞，室温孵育1小时。最后用ChemiDocTMXRS+和Image LabTMsoftware显影，并计算条带灰度值。

1.8 统计学方法：数据以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 rhEPO预处理可减轻大鼠肝脏缺血/再灌注损伤（图1）：检测大鼠血清中的AST和ALT变化反映肝功能情况，结果显示，IRI处理后血清中两种转氨酶的释放量均有明显增加。但是，rhEPO组AST和ALT的释放量均较对照组低〔AST（U/L）：582.0±52.5 比 245.0±31.7； ALT（U/L）：388.0±39.6比166.0±24.3，P ＜ 0.05）〕，提示肝损伤较轻。组织病理结果显示，肝脏70%缺血/再灌注后造成明显的肝组织损伤，肝组织形态出现异常，如肝细胞坏死、肝细胞的细胞质液泡化以及中性粒细胞浸润等，肝损伤评分较高，而采用rhEPO预处理的肝组织损伤明显较轻。

图1 rhEPO预处理对肝脏缺血/再灌注损伤的影响

2.2 rhEPO预处理进一步活化了PI3K/AKT信号通路（图2）：提取肝组织总蛋白，Western Blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白p85和AKT的表达和活化情况。结果显示，肝脏经历IRI后，p85和AKT的蛋白总量未见明显变化，但是，p-p85和p-AKT的表达量均有明显增加；同时，给予rhEPO预处理后，p-p85和p-AKT的表达量增加尤为明显，显著高于对照组，提示IRI激活了PI3K/AKT信号通路，而rhEPO预处理则进一步活化了PI3K/AKT激活信号。

2.3 rhEPO预处理降低了IRI时肝组织中的炎性因子转录水平（图3）：提取肝组织总RNA，实时定量PCR检测IRI肝组织中的炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达量。结果显示，和假手术组比较，IRI引起肝脏TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相对表达量显著升高，但是，给予rhEPO预处理组TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相对表达量均明显低于对照组。

图2 rhEPO预处理活化了PI3K/AKT信号通路

图3 rhEPO预处理降低了IRI时肝组织中的炎性因子转录水平

2.4 rhEPO预处理抑制了IRI时血清中的炎性因子释放（图4）：为了进一步检测rhEPO预处理对IRI过程中血清炎性因子的释放情况，使用ELISA法对不同处理组血清中的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量进行测定。结果显示，与假手术组相比较，对照组引起血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量显著升高，但是，给予rhEPO预处理后TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量均明显低于对照组〔TNF-α（pg/ml）：425.0±31.2比 227.0±19.7；IL-6（pg/ml）：353±26.4 比 189±16.3；IL-1β（pg/ml）：511.0±39.6 比 328.0±23.2，均 P ＜ 0.05）〕。

图4 rhEPO预处理抑制了IRI时血清中的炎性因子释放

3 讨 论

EPO是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，属于集落刺激因子，在骨髓造血微环境下能发挥促进红细胞生成的作用，研究表明其具有搞氧化［7］、搞炎［8］、搞细胞凋亡［9］和促血管生成［10］的特性，但是其对缺血/再灌注引起的肝损伤是否具有保护作用，目前研究极少。因此，我们通过建立大鼠70%肝脏组织IRI模型，阻断血流1小时后恢复肝脏血供3小时，观察肝损伤情况。组织学分析显示，缺血/再灌注造成明显的肝组织损伤，组织形态出现异常，出现肝细胞坏死、细胞质液泡化以及中性粒细胞浸润。值得注意的是，在术前1小时，行尾静脉给药的情况下，缺血/再灌注造成的肝组织病理变化明显减轻，说明rhEPO预处理能显著减轻缺血/再灌注造成的肝损伤。因此，我们认为rhEPO预处理是防治肝脏IRI的有效措施之一。

为了进一步探索其机制，我们测试了与免疫调节有关的PI3K/AKT信号传导途径。PI3K激酶由一个催化亚基p110和一个调控亚基p85组成，它的激活依赖于p85激活［11］。一旦p85被激活，它就会向p-AKT发出信号，这与炎症反应有关［12］。由PI3K激活的AKT可通过促凋亡蛋白、转录因子和激活内皮一氧化氮合酶生成一氧化氮来调控细胞存活［13］。最近发现PI3K/AKT通路的激活可以显著减轻大脑 IRI［14］和心肌 IRI［15］。研究表明，IRI诱导了PI3K的p85调控亚基的激活，对照组大鼠的p-p85水平明显高于假手术组大鼠。令人惊讶的是，在大鼠体内的rhEPO预处理进一步增强了p85的活性。这一结果促使我们深入研究了AKT的活性，因为p85的磷酸化会使AKT产生活性。与上述结果一致，p-AKT的表达也明显增加，rhEPO增强了AKT的活性。

为了进一步证明增强的PI3K/AKT信号能抑制炎症反应，我们随后在IRI肝脏组织中选择性地测定了TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。结果显示，rhEPO预处理的大鼠表现出明显较低的TNF-α、IL-6和IL-1β表达量。总之，我们的数据说明rhEPO增强了PI3K/AKT的活化信号，然后抑制了炎症反应，保护肝脏不受IRI的影响。在调节适应性免疫反应方面，PI3K/AKT通路一直被认为是很重要的［16］。例如，不同的PI3K异质二聚体可以分别控制细胞增殖和存活、B和T细胞受体信号，以及B和T淋巴细胞的趋化性［17-18］。最近，人们越来越多地发现，在固有免疫细胞中，PI3K/AKT通路具有广泛而显著的作用［19-20］。固有免疫细胞迁移至受损的组织或器官，需要对细胞骨架和膜结构进行动态重组，而PI3K信号则是提供细胞极性和伪足扩展来实现这一过程的关键［18］。有研究显示，PI3K的激活减弱了Geniposide引起的肝脏IRI［21］，因此，本实验没有进行额外的研究，以证明激活的PI3K/AKT信号抑制了在肝内引起的免疫反应。值得注意的是，rhEPO减轻肝脏IRI损伤可能会涉及到其他途径，而不仅仅是PI3K/AKT信号，如MAPK激酶级联信号［3］，这将是下一步的研究重点。

总之，本研究有力地说明了rhEPO预处理可以改善IRI引起的肝脏损伤，表现为肝脏组织病理变化较轻以及炎性浸润明显减弱。机制研究表明，rhEPO增强了PI3K/AKT信号的激活，从而抑制了炎症的渗透以缓解肝脏IRI。以上结果提示，rhEPO在临床实践中可以作为预防或治疗肝脏IRI的一种很好的替代疗法。