木鳖果假种皮中β-胡萝卜素的提取工艺优化及稳定性研究

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(北京林业大学生物科学与技术学院,食品加工与安全北京市重点实验室,北京 10083)

木鳖果(Momordicacochinchinensis)为葫芦科苦瓜属草本植物,原产于东亚和东南亚地区,在中国主要分布于南部地区[1],是迄今为止发现的β-胡萝卜素含量最高的水果[2]。目前,国外研究者对木鳖果中功能成分的种类、含量进行了广泛的研究,发现木鳖果果肉中番茄红素与β-胡萝卜素含量虽仅有0.380～0.408、0.083～0.769 mg/g[3],但其在假种皮中含量丰富,故被誉为“来自天堂的水果”[4-5]。同时其假种皮中还含有丰富的维生素E以及ω-3-脂肪酸[6],对于开发木鳖果类新型产品有极其重要的作用。而我国对于木鳖果的研究尚处于起步阶段,针对木鳖果假种皮中β-胡萝卜素的提取工艺以及性质等的研究更是一片空白。人们对木鳖果的营养价值认识不足,仅利用其提取色素制糯米饭或提取木鳖果油[7],其中含量很高的类胡萝卜素物质未被充分利用,且木鳖果中β-胡萝卜素在食品应用中仍存在一些问题[8]有待深入研究。

β-胡萝卜素(C40H56)是一种红紫至暗红色、有光泽的斜六面体或结晶性粉末,有轻微异臭或异味,不溶于水,难溶于甲醇、丙二醇、酸和碱,易溶于二硫化碳、氯仿、乙烷及植物油[9-10],具有高维生素A原活性和强抗氧化特性[11],广泛应用于食品体系中。β-胡萝卜素作为一种强抗氧化剂,具有高效猝灭单线态氧和清除自由基的作用。它不但具有防癌抗癌、防辐射抗衰老的特点,而且还可以清除香烟和汽车废气中的有毒物质。由于天然β-胡萝卜素具有合成品没有的特性[12-17],它广泛应用于食品着色、营养保健、药品及饲料四大领域[18-19]。因此,如何高效地从天然植物中提取β-胡萝卜素有十分重要的研究意义。

本文以木鳖果假种皮为原料,运用超声辅助乙醇提取法,探究其提取β-胡萝卜素的最佳工艺,并通过L9(34)正交实验对提取工艺参数进行优化,同时对木鳖果假种皮中β-胡萝卜素的稳定性进行研究,为木鳖果假种皮中β-胡萝卜素在食品加工中的应用以及综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

木鳖果 中国广西壮族自治区南宁市;β-胡萝卜素 标准品,上海阿拉丁生化科技有限公司;无水乙醇 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;柠檬酸、磷酸氢二钠 分析纯,上海阿拉丁生化科技有限公司。

GX-03 150型克多功能粉碎机 浙江高鑫工贸有限公司;LQ-A30002型电子天平 瑞安市乐祺贸易有限公司;KQ-100DE型超声破碎仪 昆山市超声仪器有限公司;L3660D型低速离心机 上海知信实验仪器有限公司;UV-6100型紫外分光光度仪 上海元析仪器有限公司;GZX-9240MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 木鳖果假种皮β-胡萝卜素的提取工艺 采用敖艳等[20]的方法提取β-胡萝卜素,方法略作修改。提供工艺流程如下:

木鳖果→去皮取假种皮→40 ℃干燥4 h去核→40 ℃干燥至恒重→粉碎、过60目筛→超声辅助提取木鳖果假种皮β-胡萝卜素→离心过滤→取上清液即为类胡萝卜素提取液

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 超声功率对β-胡萝卜素提取量的影响 准确称取1 g木鳖果假种皮粉,在超声时间为45 min,超声温度为55 ℃,料液比为1∶15 g/mL条件下,以不同超声功率(50、60、70、80、90 W)提取β-胡萝卜素,测定并计算β-胡萝卜素提取量。

1.2.2.2 超声温度对β-胡萝卜素提取量的影响 准确称取1 g木鳖果假种皮粉,在超声功率为70 W,超声时间为45 min,料液比1∶15 g/mL条件下,以不同超声温度(25、35、45、55、65 ℃)提取β-胡萝卜素,测定并计算β-胡萝卜素提取量。

1.2.2.3 超声时间对β-胡萝卜素提取量的影响 准确称取1 g木鳖果假种皮粉,在超声功率为70 W,超声温度为55 ℃,料液比1∶15 g/mL条件下,以不同超声时间(15、30、45、60、75 min)提取β-胡萝卜素,测定并计算β-胡萝卜素提取量。

1.2.2.4 料液比对β-胡萝卜素提取量的影响 准确称取1 g木鳖果假种皮粉,在超声功率为70 W,超声时间为45 min,超声温度为55 ℃条件下,以不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL提取β-胡萝卜素,测定并计算β-胡萝卜素提取量。

1.2.3 正交试验设计 在上述单因素实验的基础上,以超声功率(A)、超声温度(B)、超声时间(C)、料液比(D)为考察因素,每个因素选取3个对β-胡萝卜素提取量影响较大的水平,进行L9(34)正交优化实验。以β-胡萝卜素提取量为评价指标,对从木鳖果假种皮中提取β-胡萝卜素的提取工艺进行优化。

1.2.4β-胡萝卜素含量的测定β-胡萝卜素标准曲线的绘制:准确称量0.0125 gβ-胡萝卜素标准样品,溶于无水乙醇中,定容至50 mL,制得β-胡萝卜素标准液。分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL标准液,用无水乙醇定容至25 mL,使其浓度分别达到1、2、3、4、5 μg/mL,于451 nm处测定吸光值,以吸光值为纵坐标,标准β-胡萝卜素浓度为横坐标绘制标准曲线,根据标准曲线和样品所测吸光值,求得各处理提取液浓度。

根据翟丹云等[21]的方法测定木鳖果假种皮中β-胡萝卜素的含量,方法略作修改。

式(1)

其中:C-β-胡萝卜素浓度(μg/mL);V-提取液的体积(mL);B-稀释倍数;M-称取木鳖果假种皮粉的质量(g)。

1.2.5β-胡萝卜素的纯化 实验中β-胡萝卜素的浸提剂为乙醇,因此在色素中不可避免混入了一部分醇溶蛋白。为了进一步提高β-胡萝卜素的纯度,调节pH使其达到蛋白质的等电点并沉淀,离心过滤除去醇溶蛋白。采用刘绪广等[22]的方法除去提取液中的醇溶蛋白,方法略作修改。准确量取木鳖果假种皮色素醇溶液100 mL,用0.05 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节溶液pH,当pH调至6左右时溶液产生沉淀。随后将其放置在-15 ℃的冰箱中,冷冻12 h,肉眼可见溶液中大量絮状物沉淀,采用离心机转速4000 r/min离心10 min除去该沉淀,从而得到纯度较高的β-胡萝卜素澄清液。

1.2.6β-胡萝卜素稳定性实验

1.2.6.1 光照对β-胡萝卜素保留率的影响 采用敖艳等[20]的方法研究光照对β-胡萝卜素保留率的影响,方法略作修改。配制0.05%的木鳖果假种皮色素醇溶液,将其分别置于室外自然光及暗处,每隔24 h测定溶液的吸光值A,根据公式(2)计算保留率,研究光照对木鳖果假种皮色素的影响。

式(2)

其中:A-样品吸光值;A0-对照组吸光值。

1.2.6.2 温度对β-胡萝卜素保留率的影响 采用申海进等[23]的方法研究温度对β-胡萝卜素保留率的影响,方法略作修改。配制0.05%的木鳖果假种皮色素醇溶液,分别置于4、20、50、75、100 ℃的温度条件下,每隔1 h测定溶液的吸光值A,根据公式(2)计算保留率,研究温度对木鳖果假种皮色素的影响。

1.2.6.3 pH对β-胡萝卜素保留率的影响 采用申海进等[23]的方法研究pH对β-胡萝卜素保留率的影响,方法略作修改。配制0.05 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0),使各缓冲液中色素浓度为0.05%,放置4 ℃冰箱中,每隔1 h测定溶液的吸光值A,根据公式(2)计算保留率,研究pH对木鳖果假种皮色素的影响。

1.2.6.4 不同金属离子对β-胡萝卜素保留率的影响 采用申海进等[23]的方法研究离子对β-胡萝卜素保留率的影响,方法略作修改。配制0.05%的木鳖果假种皮色素醇溶液,分别加入浓度为0.05、1.0 mol/L的Fe3+、Fe2+、Zn2+、Na+、K+、Cu2+溶液,放置4 ℃冰箱中,24 h后测定吸光值A,根据公式(2)计算保留率,研究金属离子对木鳖果假种皮色素的影响。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行单因素实验和稳定性实验数据处理;SPSS Statistics 22.0进行极差和方差分析。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素标准曲线

β-胡萝卜素标准曲线如图1所示,方程为y=0.097x+0.045,R2=0.9992,拟合度较好,可用于测定β-胡萝卜素含量。

图1 β-胡萝卜素标准曲线Fig.1 Standard curve of β-carotene

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声功率对β-胡萝卜素提取量的影响 超声功率对β-胡萝卜素的提取量影响如图2所示。由图2可知,β-胡萝卜素提取量随着超声功率的增大呈现先增大后减小的趋势。β-胡萝卜素提取量在超声功率为70 W时最高,达到1.542 mg/g。可能的原因是随着超声功率的增大,空化作用增强,有利于β-胡萝卜素溶出;而超声功率在达到70 W之后色素基本上已经溶出,提取量不再上升。因此,选择超声功率70 W为适宜功率。

图2 超声功率对β-胡萝卜素提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on β-carotene extraction

2.2.2 超声温度对β-胡萝卜素提取量的影响 超声温度对β-胡萝卜素的提取量影响如图3所示。当温度在25～55 ℃范围内时,随着温度的升高,β-胡萝卜素提取量增加;当提取温度为55 ℃时,β-胡萝卜素提取量最高,为1.823 mg/g。而温度达到55 ℃以上时,β-胡萝卜素提取量随着温度的升高而急剧降低,可能的原因是β-胡萝卜素在温度较高的条件下不稳定,易降解[24]。因此,选择55 ℃为适宜提取温度。

图3 提取温度对β-胡萝卜素提取量的影响Fig.3 Effect of temperature on β-carotene extraction

2.2.3 超声时间对β-胡萝卜素提取量的影响 超声时间对β-胡萝卜素的提取量影响如图4所示。由图4可以看出,超声时间对β-胡萝卜素提取量的影响较小,在15～75 min中稍有波动,超声时间为45 min时,β-胡萝卜素提取量较高,为1.475 mg/g。提取时间45、60 min时β-胡萝卜素提取量变化不大;随着时间增加,β-胡萝卜素提取量下降,推测原因可能是本实验在较高温度下(55 ℃)提取β-胡萝卜素,而长时间加热会对β-胡萝卜素造成破坏,为了保证提取到的β-胡萝卜素含量更高,应选取较短时间提取β-胡萝卜素。因此,本实验选取45 min为适宜提取时间。

图4 提取时间对β-胡萝卜素提取量的影响Fig.4 Effect of time on β-carotene extraction

2.2.4 料液比对β-胡萝卜素提取量的影响 料液比对β-胡萝卜素的提取量影响如图5所示。由图5可知,料液比从1∶5～1∶25 g/mL之间,β-胡萝卜素的提取量随着料液比的增大呈现先增加后趋于平稳的趋势。当料液比达到1∶15 g/mL时,假种皮中β-胡萝卜素的提取量最高,达到1.423 mg/g。可能的原因是随着料液比的增大,β-胡萝卜素的提取量升高,当料液比大于1∶15 g/mL时,溶出的脂溶性杂质成分可与乙醇结合,导致β-胡萝卜素提取量不再上升。所以确定假种皮β-胡萝卜素的适宜提取料液比为1∶15 g/mL。

图5 料液比对β-胡萝卜素提取量的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on β-carotene extraction

2.3 正交试验结果

从表2的极差分析结果可以看出,RC>RD>RA>RB,因此4个因素对超声波辅助乙醇提取β-胡萝卜素的效果影响的大小顺序为:超声温度(C)>料液比(D)>超声功率(A)>超声时间(B)。其中,超声温度F值>F0.01,对提取量影响极显著,料液比F值>F0.05,对提取量影响显著;超声功率以及超声时间对提取量影响不大。在实验设计范围内,优化得到超声波辅助乙醇提取β-胡萝卜素的最佳条件为A1B3C3D3,即超声功率60 W、超声时间60 min、超声温度65 ℃、料液比1∶20 g/mL。

表2 L9(34)正交试验设计及结果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Variance results of orthogonal test analysis

2.4 验证试验

以2.3中正交试验得出的最佳条件为基础进行验证试验,通过计算得到的β-胡萝卜素提取量约为(2.212±0.075) mg/g,高于正交表中试验结果,说明采用正交法得到的优化工艺可行性强,优化结果可靠。

2.5 稳定性实验结果

2.5.1 光照对β-胡萝卜素稳定性的影响 光照对β-胡萝卜素稳定性的影响如图6所示。由图6可知,在避光条件下β-胡萝卜素保留率在100%左右波动,稳定性较好。但是在光照条件下,随着时间的增加β-胡萝卜素不断降解,保留率显著下降,在第5 d时保留率仅为15.28%。这说明β-胡萝卜素在强烈日光照射下极不稳定。通过对比可知,光照会使β-胡萝卜素的降解速率增加。总体来看,避光条件下有利于β-胡萝卜素的保存。

图6 光照对β-胡萝卜素稳定性的影响Fig.6 Effect of light on stability of β-carotene

2.5.2 温度对β-胡萝卜素稳定性的影响 温度对β-胡萝卜素稳定性的影响如图7所示。图7中结果显示,在4、25 ℃条件下,β-胡萝卜素的保留率在100%上下波动,波动较小;在50 ℃条件下,β-胡萝卜素的保留率稍有增加,这可能是在加热过程中溶出了其他显色色素;而在100 ℃下,β-胡萝卜素保留率明显降低,在第6 h保留率为71.37%。总体来看,β-胡萝卜素不耐高温,对低温及室温有较强的耐受性。因此低温或室温条件是保存β-胡萝卜素的有利条件。

图7 温度对β-胡萝卜素稳定性的影响Fig.7 Effects of temperature on stability of β-carotene

2.5.3 pH对β-胡萝卜素稳定性的影响 pH对β-胡萝卜素稳定性的影响如图8所示。由图8可知,在酸性条件下(pH为3.0、4.0、5.0、6.0),β-胡萝卜素的保留率较高,随着时间的增加趋于稳定,约为110.00%;在碱性和中性条件下,保留率明显下降,反应2 h后达到60.00%左右并保持稳定。实验中观察到在碱性环境(pH为8.0)时溶液中迅速产生大量黄色絮状沉淀,这说明β-胡萝卜素在碱性条件下沉降,而在测定吸光度时主要显色物质是β-胡萝卜素,因此吸光度减小。

图8 pH对β-胡萝卜素稳定性的影响Fig.8 Effects of pH on stability of β-carotene

2.5.4 不同金属离子对β-胡萝卜素稳定性的影响 离子对β-胡萝卜素稳定性的影响如表4所示。由表4可知,Na+、K+对木鳖果假种皮β-胡萝卜素的稳定性影响不大,12 h内β-胡萝卜素的保留率均约等于100%,溶液颜色稳定呈浅黄色、稍有浑浊,而其余离子对假种皮β-胡萝卜素稳定性均有一定的影响。加入Fe3+后,β-胡萝卜素的保留率明显增加,提取液颜色呈黄偏褐色,这可能是因为Fe3+本身的颜色使得溶液黄色更深,表现为吸光值明显增大。而在Fe2+、Cu2+溶液环境中,保留率降低,且随着浓度的增加,保留率更小。在Zn2+存在条件下,保留率急剧降低,在0.1 mol/L时降低至29.96%,在提取液颜色变浅的同时迅速形成大量沉淀,本实验研究结果与文献报道相似[24]。

表4 金属离子对β-胡萝卜素稳定性的影响Table 4 Effect of metal ions on stability of β-carotene

3 结论

采用超声波辅助乙醇提取木鳖果假种皮中的β-胡萝卜素时,最佳提取条件为超声功率60 W、超声时间60 min、超声温度65 ℃、料液比1∶20 g/mL,此条件下的提取量为(2.212±0.075) mg/g。

在稳定性实验研究中得出β-胡萝卜素对光照、温度、酸碱环境、离子较为敏感。β-胡萝卜素受光照、高温影响较大,在光照和100 ℃下降解较快,因此避光、低温或室温是保存β-胡萝卜素的有利条件。酸性条件对β-胡萝卜素有增色作用,保留率升高;而在碱性条件下,β-胡萝卜素发生沉降,保留率降低,因此要避免在强酸强碱环境下保存β-胡萝卜素。Fe3+对β-胡萝卜素有增色作用,而Fe2+、Zn2+、Cu2+对其有不同程度的减色作用,尤其在Zn2+存在条件下,β-胡萝卜素特别不稳定,产生大量絮状沉淀,溶液浅黄接近无色,而在Na+、K+环境下则有利于其储存。