管材对原水输送管道中微生物群落结构及氮素转化的影响

陈桃源，周正协，陈 卫，林晨烁，王月婷，许 航

(河海大学环境学院，江苏南京 210098)

原水输送管道是城市给水系统重要的组成部分，原水管道潮湿的内壁给原水中污染物和细菌的附着提供了适宜的条件，并逐渐形成天然生物膜[1]。研究表明,在供水管道中，生物膜对管壁和水体界面间的物理、化学、生物反应起到很大的作用[2]，对水体中含氮污染物的转化产生重要的影响[3]。现有针对供水管道中生物膜结构及沿程变化的研究已较为完善，对探究原水管道内生物膜对含氮污染物转化的作用具有一定借鉴价值。而原水输送过程中含氮污染物间的相互转化直接关系到水处理技术效能及其水质安全，但限于实地研究的难度，现针对原水管道的研究甚少，仅有的也只是揭示进出水中氮转化规律[4]或微生物群落结构及其多样性[5-6]，并未深入阐明含氮污染物转化的机理及其同微生物之间的关联。

管材对管壁生物膜的形成有显著影响。管材的粗糙度不同，微生物在管壁的附着度也有所不同[7-9]，管壁微生物进而会影响管道中含氮污染物的转化，因此管材对原水输送管道中含氮污染物转化的影响值得研究。鉴于现有相关研究的缺失，本研究利用原水输送管道模拟系统，根据对太湖流域原水管道管材使用的实际调研，选择应用最广的油漆内衬钢管和水泥内衬钢管为研究对象，对试验装置内的生物膜进行自然培养，考察相同水质下成熟生物膜中生物量和微生物群落结构的区别，并探究不同管材下，原水输送管道内生物膜微生物对含氮污染物转化规律的影响，为原水输送过程中及给水系统中含氮污染物的转化提供重要的理论依据。

1 试验材料和方法

1.1 试验模拟系统

本研究设计了原水输水管道模拟装置(图1)。装置由3个水平放置的同心圆柱体管道构成，外管的管材为透明的有机玻璃，内管和中间管道管材相同，视实际原水输送管道的管材而定。本试验中一套装置的内管和中间管道采用油漆内衬钢管，另一套装置为水泥内衬钢管。该装置的其他组成包括：驱动轴、发动机、推流器、毕托管、数显压差计、进水口、出水口、电磁阀、时控开关、原水箱、出水箱、潜水泵。

该原水输水管道模拟装置24 h不断循环，采用正态水力模拟系统[10-11]，每隔6 h进水、出水(模拟实际管径为1 800 mm、流速为1.4 m/s、水力停留时间为6 h的管道)。该装置的左右侧外盖可拆卸，以方便生物膜取样。

图1 原水输送管道模拟装置示意图Fig.1 Schematic Diagram of Simulator of Raw Water Diversion Pipelines

1.2 试验装置管道管材、进水水质及分析方法

1.2.1 试验装置进出水水质及测定方法

表1 试验原水水质Tab.1 Raw Water Quality for the Experiment

1.2.2 DON 分子量分布及亲疏水性测定

采用超滤膜法对进出水中DON分子量分布进行测定。在超滤杯中，放置以高纯氮气为压力驱动(压力约为0.15 MPa)的磁力搅拌器；采用截留的分子量分别为10、5、3、1 kDa的超滤膜(美国 Milipore公司)，其有效面积均为31.75 cm2。待测水样首先通过0.45 μm的微滤膜去除悬浮物质，后将水样依次通过不同截留分子量的超滤膜，从而测定过膜后水样中的DON含量，各级相减得到各分子量范围内DON含量[12]。各范围内DON的半分比计算如式(1)～式(3)。

(1)

(2)

(3)

其中：Ci—分子量在i范围内的DON浓度。

采用树脂吸附法[13]测定DON的亲疏水性。试验前将待测水样通过0.45 μm的微滤膜以去除悬浮物质，调节pH值为2后，将水样依次通过Supelite DAX-8和Amberlite XAD-4树脂，从而将待测水样中的DON分离成疏水性、亲水性和中性成分3类，具体操作步骤如图2所示。

1.2.3 试验装置管道管材粗糙度及测定方法

两种试验管材的表面绝对粗糙度如表2所示。

表2 两种试验管材的表面绝对粗糙度Tab.2 Absolute Roughness of Inner Surface of Two Types of Pipes

1.2.4 微生物指标测定

管壁生物膜中的微生物群落结构组成由宏基因组测序来测定，采用OMEGA基因组提取试剂盒(D5626-01 E.Z.N.A.Soil DNA Kit)对生物膜样品进行总DNA提取与纯化。利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对提取到的DNA精确定量。参考了Miseq测序平台的V3～V4区的通用引物后，PCR引物序列设计为341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC。

第一轮PCR 扩增，94 ℃运行3 min；5个循环：94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s；20个循环：94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s；72 ℃运行5 min。10 ℃保存后进行第二轮PCR扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，95 ℃ 30 s；5 个循环：95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；72 ℃ 5 min。10 ℃保存。完成扩增后，利用琼脂糖电泳技术对PCR产物进行分析，用Qubit 2.0 DNA回收DNA。基因组测序采用Illumina MiSeq测序平台。首先，利用barcode区分样品序列，将测序得到的结果进行处理，随后对区分后的样品序列进行质量检测(QC)，以达到去除非靶区域序列与嵌合体的目的；接着，根据序列间的距离对样品序列展开聚类分析，序列间的相似性作为域值分成操作分类单元的依据；然后，利用RDP classifier基于Bergey's taxonomy(Bergey's taxonomy分为6层，它们依次为域、门、纲、目、科、属。)，采用Naïve Bayesian assignment算法计算每条序列在属水平上分配到各层中的概率值，一般概率值>0.8，说明此分类结果可信；继而，得到各水平上的物种丰度，计算序列丰度，同时建立样本和物种分类单元序列丰度矩阵；最后，基于OTU聚类和RDP分类结果，从序列样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建稀释曲线，使用97%相似度的OTU，利用mothur做rarefaction分析，利用R语言工具制作曲线图。原水和生物膜中的细菌总数由异养菌平板计数(HPC)测定。

利用CANOCO 5.0 (Microcomputer Power，Ithaca，NY，USA)进行冗余分析[14]。冗余分析是一种约束排序线性模型分析，基于PCA排序过程加入环境因子进行线性回归，最终实现将多维数据样本(如种群、环境因子)尽可能多地排列在可视化低维空间内，使前几个排序轴囊括绝大多数的样本信息[15]，用于检测环境因子与不同分类水平微生物群落丰度之间的相关性。进行排序分析之前，首先要判断是选择线性模型，还是单峰模型的排序方法，利用97%相似性的样品OTU表做除趋势对应分析(DCA)。具体步骤：若一组种类(m个)有n个样方x，任意选择样方排序初始值yi，求种类的排序值Zi(i=1,2,3,…,m)，其数值为样方初始值的加权平均，如式(4)。

(4)

计算样方排序新值Zi(i=1,2,3,…,n)，再判定若最大排序轴梯度长度(LAG)超过4.0，则选典型对应分析CCA更合适；当3

2 结果和讨论

2.1 生物膜中的生物量比较

将运行一年的油漆内衬和水泥内衬旧管，反复冲洗至内外表面无生物膜后，重新运行，对不同管材、不同粗糙度管内壁生物膜中HPC的数量进行检测，模拟管道中管壁生物膜生长状态和成熟状态下的HPC数量变化，如图3所示。

图3 不同管材、不同粗糙度模拟管道内生物膜中HPC的数量Fig.3 Counts of HPC from Biofilm in Different Pipes with Different Roughness

由图3可知，不同管材、不同粗糙度模拟管道生物膜中HPC的生长趋势一致，装置内生物膜中微生物的生长同样经历了适应期、对数生长期、脱落期和稳定期这4个阶段。然而，HPC的数量存在数量级的差异。新旧管道模拟装置内生物膜中的HPC数量均在装置开始运行的第50 d左右达最大值，其中，油漆内衬旧管中HPC的最大值达到9.40×106CFU/cm2，油漆内衬新管中HPC最大值达到4.53×106CFU/cm2，水泥内衬旧管中HPC的最大值达到7.48×105CFU/cm2，水泥内衬新管的HPC最大值达到4.28×105CFU/cm2，随后管道内的生物膜均进入脱落期。至生物膜进入稳定期，以油漆内衬新旧模拟管道内壁生物膜中的HPC分别稳定在1.89×106～2.45×106CFU/cm2和3.15×106～4.68×106CFU/cm2，水泥内衬新旧模拟管道内壁生物膜中的HPC分别稳定在2.60×105～4.00×105CFU/cm2和4.75×105～6.19×105CFU/cm2。

邬卓颖等[7]对供水管道中生物膜生长的影响因素的研究表明：生物膜在铸铁管和铜管上的形成速率较PVC管和铝管快；与其他管材相比，铸铁管上单位面积生长的细菌数最多，而铸铁管的管壁粗糙度明显高于铝管。管道内壁的粗糙度是生物膜附着生长的重要因素，内表面粗糙度越大，微生物越易附着[16]。本试验的结果表明,成熟生物膜中油漆内衬管上的HPC数比水泥内衬管上的HPC数高一个数量级，且旧管内壁生物膜中的HPC达到稳定的速率比新管快，稳定时HPC数目明显高于新管。由表2可知，油漆内衬管无论是新管还是旧管，表面粗糙度均达到水泥内衬管表面粗糙度的10倍以上，考虑到模拟装置其他运行条件均一致，且根据饮用水卫生标准，油漆内衬和水泥内衬管的析出物质不得对水质产生较大影响，因此可判断，油漆内衬管材表面粗糙度大是造成管壁HPC数量多的重要原因。

2.2 微生物群落结构组成差异

对两套不同管材模拟管道装置中成熟的生物膜(150 d和210 d)进行宏基因组测序，以得到生物膜中的微生物种群分布(图4)。

图4 不同管材的模拟管道内壁生物膜中细菌种群组成(门的水平)Fig.4 Bacterial Communities of Simulated Pipelines with Different Lining Materials.

由图4可知，以XJ水源水为进水的条件下，两种不同管材模拟管道中，管壁生物膜中优势菌门是给水系统中的常见菌门[17]，包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门(Chloroflexi)等，然而各类优势菌门在两种管材模拟管道内的丰度不尽相同。

油漆内衬管在运行150 d后，管中变形菌门的含量为49.68%，运行至210 d后，变形菌门相对丰度增至53.75%；运行150 d后，水泥内衬管中变形菌门含量为55.08%，210 d后为56.80%。运行了150 d和210 d的油漆内衬管装置中拟杆菌门的含量分别为14.06%和11.03%，水泥内衬管则分别为24.36%和22.16%；蓝藻和酸杆菌门在不同管材装置中的丰度相近；厚壁菌门在运行了150 d和210 d的油漆内衬管中含量高达3.49%和4.03%，而水泥内衬管中的含量很少，仅为0.21%(150 d)和0.72% (210 d)。油漆内衬管中硝化螺旋菌门的含量为2.04%(150 d)与1.85% (210 d)，水泥内衬管中硝化螺旋菌门的含量为2.15%(150 d)与2.09%(210 d)。该结果与供水管道相关研究[18]中的结论类似，即不同管材中生物膜内细菌群落的分布存在差异，而原水输送管道内含氮污染物的转化是各种细菌共同作用的结果。

图5 不同管材的模拟管道内壁生物膜中微生物稀疏曲线Fig.5 Sparse Curves of Microfilm in Different Simulated Pipelines

对测序序列进行随机抽样，将抽到的序列数与其所能代表操作分类单元(OTU)的数目构建曲线，即稀释曲线。稀释曲线是评估样品中微生物群落多样性的分析方法之一，同时也可用于说明样本的取样大小是否合理。由图5可知，随着16S rDNA序列条带数目增加，曲线斜率不断减小而趋向平坦，最终取样数量的增加不会产生大量新的OTU，因此取样的数量合理。当原水管道的管材及粗糙度不同时，模拟管道生物膜中的微生物表现出不同的生物多样性。微生物稀疏曲线从高到低依次为油漆内衬旧管、油漆内衬新管、水泥内衬旧管和水泥内衬新管，而粗糙度从大到小也具有相同的排列顺序，这表明油漆内衬管生物膜中微生物多样性高于水泥内衬管，旧管生物膜中的微生物多样性高于新管。王薇等[19]研究了管材对供水管道中生物膜微生物多样性的影响，结果显示，灰口铸铁管中生物膜微生物种群的多样性最高，镀锌管中的微生物多样性次之，不锈钢复合管中生物膜微生物种群多样性最低，管材表面的粗糙度、亲疏水性、是否带电荷等物化特性在很大程度上影响细菌的附着行为。总结以上可归纳为：管道中微生物种群多样性基本随着管材表面粗糙度的减小而降低。本研究的结果与王薇等[19]的研究结果基本一致，粗糙度高的油漆内衬钢管中生物膜微生物多样性高于粗糙度低的水泥内衬钢管中生物膜微生物多样性。

2.3 进出水中含氮污染物含量的变化及其与微生物的关系

图6 不同管材的模拟管道中的含量变化Fig.6 Variation of Transformation Rate of Concentration in Simulated Raw Water Diversion Pipelines with Different Pipe Materials

图7 不同管材的模拟管道中的含量变化Fig.7 Variation of Transformation Rate of Concentration in Simulated Raw Water Diversion Pipelines with Different Pipe Materials

图8 不同管材模拟管道中的含量变化Fig.8 Variation of Transformation Rate of Concentration in Simulated Raw Water Diversion Pipelines with Different Pipe Materials

2.3.2 含氮污染物变化率与微生物的关系

注：P1-变形菌门；P2-酸杆菌门；P3-拟杆菌门；P4-浮霉菌门；P5-厚壁菌门；P6-硝化螺旋菌门；P7-绿弯菌门；P8-放线菌门图9 含氮污染物转化率与微生物种群相对丰度RDA分析图Fig.9 Redundancy Analysis (RDA) of Transformation Rate of Nitrogen Pollutants and Abundance of Microbial Communities

2.3.3 进出水中DON含量的变化

管壁生物膜生长成熟的模拟管道装置中，两种不同管材条件下，管道进出水中DON的浓度变化率如图10所示。

图10 不同管材的模拟管道中DON的含量变化Fig.10 Variation of Transformation Rate of DON Concentration in Simulated Raw Water Diversion Pipelines with Different Pipe Materials

试验期间，XJ水源水中DON的浓度为0.290～0.927 mg/L。由图10可知，当管壁生物膜生长成熟后，两套管道出水中DON均有一定程度的增加，以油漆内衬管为管材的管道出水中DON的浓度较进水增加了67.7%～85.6%，以水泥内衬管为管材的管道出水中DON的浓度较进水增加了53.8%～78.6%。结合图3可知，油漆内衬管内生物膜中HPC的数量为1.89×106～2.45×106CFU/cm2，水泥内衬管内生物膜中HPC的数量为2.60×105～4.00×105CFU/cm2，比油漆内衬管低了一个数量级。因此，在其他条件一致的情况下，油漆内衬管中的微生物数量更多，汲取了原水中更多的营养物质，产生了更多的代谢产物，导致原水在油漆内衬管内输送时释放出更多的DON，该结果也与2.3.2节的结果一致。

2.3.4 进出水中DON分子量分布及亲疏水性差异

两套不同管材的模拟管道中进出水DON分子量分布及亲疏水性变化分别如图11、图12所示。由图11可知，XJ水源水中DON分子量分布以小分子(<5 kDa)为主，所占比例为62.2%～76.0%。由图12可知，XJ水源水中亲水性DON所占比例为57.6%～64.2%。

图11 不同管材中DON分子量分布的变化 (a：油漆内衬管；b：水泥内衬管)Fig.11 Distribution Change of DON Molecular Weight in Different Simulated Pipelines (a: Paint Liner； b:Cement Liner)

图12 不同管材中DON亲疏水性的变化 (a：油漆内衬管；b：水泥内衬管)Fig.12 Hydropathy Property Change of DON in Different Simulated Pipelines (a: Paint Liner； b: Cement Liner)

研究不同管材模拟管道进出水中DON分子量分布变化发现，油漆内衬管出水中小分子DON所占比例达到88.3%～95.3%，水泥内衬管出水中小分子DON所占比例为84.6%～94.1%。结合图3可知，油漆内衬管内HPC的数量比水泥内衬管高了一个数量级，数量多的HPC生长代谢过程中产生更多的小分子DON。而由图4可知，油漆内衬管和水泥内衬管中拟杆菌门的丰度分别为14.06%和24.36%，由已有的研究结论可知，拟杆菌门在给水系统内有机物的降解和小分子DON的释放中发挥着重要的作用[25]。Amy[26]研究发现，水体中亲水性有机物主要来源于水源水中藻类生长繁殖分泌出的氨基酸、氨基糖、缩氨酸和蛋白质等亲水性物质。XJ水源水中的营养物质存在水平较高，藻类物质较多，两种管材模拟管道中亲水性DON均有大幅度增加。因此，两套不同管材管道出水中小分子DON的含量差异不大，是管道中HPC的数量、拟杆菌门的丰度以及其他生物因素共同作用的结果。

DON中的胺类(NH2)、硝基(NO2)、酰胺(CONH2或CONH-R)和腈类(CN)等多种含氮官能团，是水中DON的亲水性组分，通过研究不同管材条件下模拟管道进出水中DON亲疏水性变化发现，XJ水源水中亲水性DON占比略高于疏水性DON，为57.6%～64.2%。两套模拟装置出水中DON亲疏水性差异不大，以油漆内衬管和水泥内衬管为管材的管道出水中亲水性DON占比分别为78.8%～84.9%和72.8%～80.2%，较管道进水均上升约20个百分点。由此认为，不同管材对原水输送中DON亲疏水性变化无显著影响。

3 结论

(1)两套不同管材模拟管道经相同运行时间后，管材表面粗糙度较高的油漆内衬新管的模拟管道管壁生物膜中的HPC稳定在1.89×106～2.45×106CFU/cm2，高于水泥内衬新管的2.60×105～4.00×105CFU/cm2，旧管中生物膜的HPC数目普遍高于新管。