不同消毒药剂及激素对桑树冬芽组织培养的影响

冯 蔚 李镇刚 冉瑞法 肖圣燕

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

桑树(MorusalbaL.)属多年生木本植物，是我国重要的经济树种，其叶片为家蚕的饲料[1]。桑树组织培养是分离树体的器官或组织的一部分(外植体)接种到培养基上，在无菌和人工控制的条件下进行培养，使其生长发育，并再生成完整植株的过程[2]。虽然桑树的组织培养研究起步较晚，但桑树的组织培养也取得了一定的进展[3-5]，其中桑树冬芽是比较好的桑树组织培养外植体[6]。目前，主要通过控制细胞分裂素6-BA(6-苄氨基嘌呤)和生长素NAA(α-萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)的浓度和类别来研究桑树的组织培养[7-8]，许多学者做了大量关于植物组织培养中外植体消毒剂种类的研究，常用的外植体消毒剂有升汞、次氯酸钠、漂白粉、过氧化氢、新洁尔灭等，其中升汞被普遍用于桑树组织培养的消毒，虽然升汞的灭菌效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗，而且对环境危害大，对人畜的毒性极强[9-10]。本试验旨在研究NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽组织培养初期冬芽生长情况的影响，以期能够筛选出适合桑树冬芽组织培养的生长调节剂最优组合，提高桑树冬芽组织培养的成功效率，同时研究一种毒副作用小又廉价的消毒方法来避免或者减轻外植体的污染，以降低桑树冬芽组织培养的成本并保护生态环境。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试桑树冬芽 试验用桑树冬芽采自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所种质资源圃，桑树品种为农桑14号。2017年1月3日从种质资源圃剪取带有5～6个冬芽的茎段，带回实验室，在无菌条件下剥去外层芽鳞，至第1幼叶露出时，切取冬芽作为外植体备用。

1.1.2 主要试剂 基本培养基WPM(wood plant medium)，木本植物用培养基，青岛日水生物技术有限公司产品；NAA，化学纯，上海埃博商贸有限公司产品；6-BA，生化试剂，上海新兴化工试剂研究所产品；次氯酸钙，粉剂，有效氯含量为28%，广西田东锦星化工有限公司产品；3%过氧化氢溶液，昆明泰立康工贸有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度次氯酸钙溶液的配制 将次氯酸钙粉剂用蒸馏水分别配制成3%次氯酸钙溶液(有效氯含量为0.84%)、10%次氯酸钙溶液(有效氯含量为2.80%)、20%次氯酸钙溶液(有效氯含量为5.60%)备用。

1.2.2 不同消毒药剂对桑树冬芽组织培养的影响试验 试验材料分别用3%次氯酸钙溶液、10%次氯酸钙溶液、20%次氯酸钙溶液和3%过氧化氢溶液处理，每种消毒药剂处理时间分别为1、3、5、10 min，消毒处理后用无菌水对桑树冬芽进行冲洗，冲洗5遍，然后将冲洗完的冬芽接种在WPM培养基中，平均7 d更换1次培养基，在第1次更换培养基时，调查不同消毒药剂对桑树冬芽组织培养的影响。

1.2.3 NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽组织培养的影响试验 在WPM培养基中，添加外源激素NAA和6-BA。NAA设2个浓度梯度，分别为0.01、0.02 mg/L，6-BA设3个浓度梯度，分别为0.30、0.60、0.90 mg/L，并设WPM培养基中不添加任何外源激素为空白对照，分析2种激素不同浓度组合对桑树冬芽组织培养的影响。每个处理接种3个桑树冬芽，重复10次，各处理和重复随机排列。桑树冬芽组织培养环境为温度25～28 ℃，相对湿度50%左右，每天光照12 h，光照强度1 000～2 000 lx，保持一定的通气性，平均7 d更换1次培养基，在第1次更换培养基时，测量桑树冬芽的直径和长度生长量，培养30 d后，调查冬芽的长势。

1.3 数据统计与测量方法

统计计算不同消毒药剂、不同处理时间下桑树冬芽的污染率和死亡率。桑树冬芽直径和长度生长量的测定参照文献[11]的方法进行。用游标卡尺测量其直径和长度，计算桑树冬芽增大倍数。计算公式如下：污染率(%)=(桑树冬芽污染数量/桑树冬芽接种数量)×100；死亡率(%)=(桑树冬芽死亡数量/桑树冬芽接种数量)×100；桑树冬芽直径增大倍数=(最终桑树冬芽直径-接种桑树冬芽直径)/接种桑树冬芽直径；桑树冬芽长度增大倍数=(最终桑树冬芽长度-接种桑树冬芽长度)/接种桑树冬芽长度。NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽生长的影响数据用邓肯氏新复极差检验法进行检验。

2 结果与分析

2.1 不同消毒药剂对桑树冬芽消毒效果的影响

从表1和图1可以看出，与3种不同浓度的次氯酸钙溶液相比3%过氧化氢溶液的消毒效果较差，污染率较高，不适合做桑树冬芽组织培养的消毒药剂。不同浓度次氯酸钙溶液做消毒药剂时不仅污染率均低于3%过氧化氢溶液，且随着次氯酸钙溶液处理时间的延长，次氯酸钙溶液浓度的增大，污染率呈下降的趋势。特别是10%次氯酸钙溶液和20%次氯酸钙溶液在消毒时间延长到5 min后，污染率就降到了0。

表1不同消毒药剂对桑树冬芽消毒效果的影响

消毒药剂处理时间/min污染率/%3%次氯酸钙溶液140340520101010%次氯酸钙溶液1303205010020%次氯酸钙溶液120310501003%过氧化氢溶液11003805601050

图1 不同消毒药剂对桑树冬芽消毒效果的影响

2.2 NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽生长的影响

从表2和图2可以看出，将剥好的桑树冬芽，接种于含有不同浓度的NAA和6-BA的WPM培养基中，待其生长1个月后，与对照相比，WPM培养基中加入生长调节剂后的桑树冬芽生长均不同程度地得到了促进，其中NAA和6-BA分别为0.01 mg/L和0.60 mg/L的生长调节剂浓度组合对桑树冬芽生长的影响最为显著，桑树冬芽膨大明显，基本可略见叶形，有大叶长出。WPM培养基中加入其他配比的生长调节剂，浓度较低无法对桑树冬芽的生长起到明显的促进作用，浓度过高又会对桑树冬芽的生长产生抑制作用。本次试验结果表明，在WPM培养基中加入0.01 mg/L的NAA和0.60 mg/L的6-BA是最适宜的桑树冬芽组织培养的生长调节剂浓度组合。

表2NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽生长的影响

培养基直径增长幅度/cm长度增长幅度/cm冬芽长势WPM+0.01 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA3.162±0.418 ab4.092±0.699 ab略有膨大,少见显露叶组织WPM+0.01 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA4.274±0.595 a5.478±0.892 a膨大明显,基本可略见叶形,有大叶长出WPM+0.01 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA3.192±0.350 ab3.200±0.879 abc均略有膨大,稍显露叶组织WPM+0.02 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA3.508±0.286 ab4.068±0.646 ab均有膨大,部分显露叶组织,部分有1片小叶展出WPM+0.02 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA3.338±0.869 ab2.856±0.951 bc均有膨大,稍显露叶组织,极少见有1片小叶略展出WPM+0.02 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA3.856±0.220 ab3.370±0.369 abc均有膨大,基本显露叶组织,均有1片小叶长出WPM(CK)2.626±0.675 b1.194±0.320 c膨大不明显,极少见显露叶组织

表中同列数值后标记的不同字母表示差异达0.05 显著水平(邓肯氏新复极差检验)。

A.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA，B.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA，C.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA，D.WPM+0.02 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA，E.WPM+0.02 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA，F.WPM+0.02 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA，G.WPM(CK)。图2 基本培养基WPM中添加不同浓度组合NAA和6-BA的桑树冬芽生长情况

3 小结与讨论

本试验研究了4种消毒药剂不同的处理时间对桑树冬芽外植体的消毒效果，10%次氯酸钙溶液和20%次氯酸钙溶液消毒5 min时污染率已经降到最低为0，但考虑到消毒简便、成本低廉及消毒药剂对外植体的损伤程度低等因素[12]，10%次氯酸钙溶液消毒5 min是最适宜的消毒方法。另外，生长素类和细胞分裂素类的比例是控制组织培养中芽和根分化的决定性因素之一[13]。一般来说高浓度的细胞分裂素与低浓度的生长素配合可直接诱导外植体再生不定芽或诱导生成胚状体[10]。植物激素在桑树组织培养形态发生过程中也起着重要作用，细胞分裂素是桑芽培养的关键因素。研究表明，6-BA更适合桑树无菌芽的继代增殖[14-16]，目前，主要通过控制细胞分裂素6-BA和生长素NAA、IBA、2，4-D的浓度和类别来研究桑树的组织培养[17-18]，本试验研究比较了WPM培养基中加入NAA和6-BA不同浓度组合对桑树冬芽外植体组织培养的影响，其中WPM培养基中添加0.01 mg/L的NAA和0.60 mg/L的6-BA，桑树冬芽的生长情况最好，冬芽直径的增长幅度和长度的增长幅度与对照相比都达到了显著水平，桑树冬芽膨大明显，基本可略见叶形，有大叶长出。

本试验研究了生长调节剂对桑树冬芽组织培养初期冬芽直径和长度生长情况的影响，国内虽有针对外植体组织培养中生长情况测量的报道[11]，但在桑树组织培养中还未得到应用。生长情况测量虽然在一定程度上增加了污染的概率，但在桑树冬芽组织培养的调控上有了量化的指标，并在组织培养初期就可筛选出较好的培养条件，提高了桑树冬芽组织培养的效率。

本试验没有对pH值、糖类以及其他因素进行试验研究，这有待于进一步试验研究。