一种家蚕丝腺体外培养和基因瞬时表达分析的方法

陈艳花 沈兴家

(1江苏科技大学生物技术学院，江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室，江苏镇江 212018；2中国农业科学院蚕业研究所，农业部蚕桑遗传改良重点实验室，江苏镇江 212018)

家蚕(Bombyxmori)是世界上重要的经济性昆虫，也是鳞翅目重要的具有中国特色的模式生物[1]。但是，家蚕培养细胞系少，目前普及的只有源于卵巢的BmN细胞[2]，严重影响了其作为模式生物的应用。家蚕丝腺是高度特化的器官，具有高效合成蚕丝蛋白的能力。但是，对于蚕丝蛋白高效合成的分子机制至今尚未明了。以往一般认为家蚕丝腺合成的几乎是单一的蚕丝蛋白，但是近年的研究表明蚕丝蛋白是一个非常复杂的蛋白复合体[3]。丝腺细胞培养系的建立，对于蚕丝蛋白合成和表达调控机制的研究无疑具有重要的意义。西南大学曾建立1个丝腺细胞系BmSG-SWU1[4]，但目前尚未普遍使用。组织体外培养是将从活体取出的组织给予充足的营养，在无菌等条件下生长，并维持原有的结构和功能[5]。其在一定程度上可以代表体内试验，且操作相对简单。为了研究家蚕microRNAs对蚕丝蛋白的表达调控，目前使用的BmN细胞瞬时表达分析系统，不能完全代表体内的试验，有时甚至可能得出与体内试验相反的结果。为此，我们尝试并建立了一种采用TC-100培养基培养5龄2 d幼虫丝腺组织的方法，为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制提供新的技术途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试家蚕品种 P50，由农业部蚕桑遗传改良重点实验室(江苏省蚕桑生物学与生物技术重点实验室)保存，解除滞育的越年蚕卵或浸酸后的蚕卵于25 ℃催青，孵化后常规新鲜桑叶饲养。

1.1.2 主要试剂 PBS缓冲液，0.10 mM/L，pH 7.2～7.4，Sangon Biotech公司产品。双抗(青霉素和链霉素)，Gibco公司产品；昆虫细胞培养基TC-100，Applichem公司产品；胎牛血清，Corning公司产品；转染试剂EntransterTM-H4000，Engreen北京生物科技有限公司产品；反转录试剂盒，Takara(大连)公司产品；荧光定量试剂盒SYBR Green PCR kit，Qiangen公司产品。

1.1.3 主要仪器 20/20 Luminometer荧光素酶检测仪，Promega公司产品；DP80型荧光显微镜，Olympus公司产品；LightCycler®96荧光定量PCR仪，Roche公司(USA)产品；SPX-250型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制 0.01 mM/L，pH6.2的PBS缓冲液配制：取50.0 mL 0.10 mM/L，pH7.2～7.4的PBS缓冲液溶于300.0 mL双蒸水中，加0.5 mL双抗，用盐酸调pH值至6.2，加双蒸水定容至500.0 mL，灭菌，4 ℃保存备用。

TC-100培养基配制：称取22.09 g TC-100培养基和0.35 g NaHCO3溶于800.0 mL灭菌水，盐酸调节pH至6.2，定容至1.0 L，0.22 μm滤膜过滤，加100.0 mL胎牛血清和1.0 mL双抗，4 ℃保存备用。

1.2.2 丝腺解剖 昆虫解剖工具(解剖板、剪刀、镊子、大头针等)用75%的乙醇擦洗消毒。选取健康且大小形态相近的5龄2 d幼虫数头，用75%的乙醇进行体表消毒，再用灭菌水冲洗去除乙醇。将灭过菌的培养皿放在冰上，倒入事先准备好的PBS缓冲液。用大头针将家蚕幼虫腹部朝上固定在解剖板上，剪开腹部表皮，再用大头针固定拉开的表皮，用镊子轻轻将丝腺拉出，放入PBS缓冲液中。

1.2.3 丝腺体外培养 将丝腺在75%的乙醇中快速漂洗，再用PBS缓冲液冲洗2～3次。放入每孔含有800 μL TC-100培养基的12孔细胞培养板的培养孔中，每孔中4条丝腺组织，置于培养箱中27 ℃培养，根据需要开展转染和瞬时表达研究。

1.2.4 丝腺转染 将4 μL转染试剂与25 μL不完全培养基(不含有血清和抗生素)孵育5 min，0.64 μg增强荧光蛋白基因egfp表达质粒pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40][6]和25 μL不完全培养基混合，再将2者混合孵育15 min。然后加入到事先放有丝腺组织的12孔细胞培养板的培养孔中转染丝腺组织，以不转染任何质粒的丝腺组织为空白对照，48 h后在荧光显微镜下观察转染效果。再进行miR-0031*[7]对家蚕丝素轻链基因BmFib-L表达调控试验，将人工合成的miR-0031*的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)各10 μL(200 mmol)按照上述方法孵育和转染，每种处理3个重复。48 h后，收集每孔中的丝腺组织，提取总RNA。设计上下游引物(BmFib-L F：5′-GATACTCTGTCGGACCAGCC-3′，BmFib-L R：5′-AGCGATGTTGTTGCTTTGGC-3′)，以总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA；再以第一链cDNA为模板进行荧光定量PCR[8]，检测不同处理后BmFib-L基因的表达量，以每100 ng RNA中基因的拷贝数表示。

2 结果与分析

2.1 丝腺组织体外培养和转染效果观察

丝腺组织体外培养和转染48 h后，分别观察培养和转染效果。结果表明，转染48 h后丝腺组织正常，培养基清澈，丝腺组织状态良好(图1-A)。

A.丝腺组织的状态(明场)，B. 丝腺组织中egfp的表达(荧光)，C. 不转染质粒的丝腺(荧光)。图1 转染后48 h丝腺组织体外生长状态和荧光显微镜观察

转染48 h后荧光显微镜观察，转染pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]的丝腺组织发出亮绿色荧光，表明egfp在离体培养的丝腺组织中得到了表达(图1-B)；而在不转染质粒的丝腺组织(空白对照)中，未观察到亮绿色荧光(图1-C)，即表明没有egfp表达。

2.2 离体培养的丝腺组织BmFib-L表达水平的qPCR分析

bmo-miR-0031*的inhibitor和 inhibitor negetive control 转染48 h后，qPCR检测丝腺组织中BmFib-L基因的表达水平，结果显示，inhibitor显著增强BmFib-L的表达水平(图2)，表明miR-0031*能够下调BmFib-L的表达，同时表明体外培养丝腺进行转染等试验是可行的。

图2 bmo-miR-0031*的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)转染体外培养的丝腺组织后BmFib-L基因表达的变化

3 小结

组织培养即模拟体内环境，对离体组织进行无菌培养，以研究组织特定条件下或处理后的生理生化、基因表达等变化，具有重要的应用价值。目前植物组织培养被广泛应用，为植物新品种的繁殖推广带来了极大的便利[9]。但是，昆虫等动物组织的体外培养研究较少。本试验建立的丝腺组织体外培养，不仅可以为研究家蚕丝腺细胞生理生化、蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制等提供新的技术途径，也可以为家蚕其他组织的体外培养和研究提供借鉴。

试验过程中使用含有双抗的PBS缓冲液，目的是在解剖丝腺过程中，作为平衡营养液以防止丝腺吸水或者脱水，也用作后期的漂洗。丝腺放入培养基之前，要用75%的乙醇快速漂洗，动作要轻，时间尽量短，以免伤害组织细胞；漂洗后再用PBS缓冲液冲洗2～3次，洗去丝腺上附带的杂质以及解剖过程中产生的污染物。丝腺培养过程中，可根据丝腺组织的状态，适时更换培养基。