竹叶黄酮提取工艺及不同竹种黄酮含量的研究

侯明果

重庆市永川国有林场 重庆 402160

1 竹叶黄酮提取工艺的研究

1.1 试验材料

毛竹一年生长成叶。

1.2 主要药品与试剂

芦丁标准品、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、蒸馏水。试验中所用试剂均为市售分析纯。

1.3 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计、分析天平、真空抽滤机、恒温水浴锅、恒温干燥箱、万能粉碎机、酒精计、移液器、移液管、容量瓶、量筒、三角瓶、烧杯、玻璃棒、胶头滴管、洗耳球、漏斗、定性滤纸、封口膜、橡皮筋、剪刀、药勺。

2 方法

2.1 准备工作

准备好试验所用的药品与试剂、仪器与设备；采取毛竹叶，并在55℃左右的温度下将其烘干，粉碎备用；用亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠试剂分别配制5%的亚硝酸钠溶液、10%的硝酸铝溶液、4%的氢氧化钠溶液，用乙醇分别配制20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，备用。

2.2 标准曲线的制定

准确称取干燥至恒重的芦丁标准品20mg，置于50ml烧杯中，加适量70%乙醇溶液，水浴微热使溶解，放冷，将溶液转入50ml容量瓶中，并用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，得浓度为0.4mg/ml的芦丁标准液。

准确吸取芦丁标准液 1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置于25ml容量瓶中，用70%乙醇溶液补充至6ml，加入1ml浓度为5%的NaNO2溶液，摇匀，静置6min，加入1ml浓度为10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min，加入10ml浓度为4%的NaOH溶液，摇匀，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置15min，以70%乙醇溶液为空白参比，在510nm的波长下用比色法测定吸光度。

以吸光度(y)为纵坐标，芦丁标准溶液浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，得标准回归方程为：y=12.192x+0.0155，r=0.9997。

2.3 竹叶黄酮的提取与测定

2.3.1 竹叶黄酮提取液的制备

称取约2g毛竹叶粉末，并准确记载称取的质量，置于三角瓶中，加入所选择浓度和体积的乙醇溶液，摇匀，并在所选择的温度下和时间内加热，抽滤，将滤液保留并将滤渣置于三角瓶中，加入浓度和体积与之前相同的乙醇溶液，并在与之前的温度和时间都相同的条件下加热，再抽滤，并将此次所得滤液与上次的滤液合并，将合并后的滤液定容至100ml，摇匀，得竹叶黄酮提取液。此方法与过程应当重复三次。

2.3.2 竹叶黄酮的测定

准确吸取5ml竹叶黄酮提取液于25ml容量瓶中，加入1ml70%的乙醇溶液，摇匀，加入1ml 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6min，加入10% AL(NO3)3溶液，摇匀，静置6min，加入10ml 4%NaOH溶液，摇匀，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置15min，过滤，以70%乙醇溶液为空白参比，在510nm的波长下用比色法测定吸光度[2]。此方法与过程应当重复三次。根据吸光度和回归方程计算黄酮含量并依据以下公式求得总黄酮含量：总黄酮含量（mg/g）=黄酮含量（mg/ml）×稀释倍数（5倍）×滤液定容体积（100ml）/竹叶干粉质量（g）。

2.4 水浴提取单因素试验

从提取温度60℃、固液比1：15、提取时间1.5h、乙醇体积分数60%中依次选择3个因素固定条件，剩余一个因素条件依次分成 5 个梯度（乙醇体积分数 20%、40%、60%、80%、90%，固液比 1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，提取时间 0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），按2.3的方法与过程对竹叶黄酮进行提取与测定。

2.5 水浴提取正交试验

根据单因素试验结果，在四个因素中各取3个水平，进行L9(34)正交试验，试验方法与过程按2.3进行。采用 DPS 软件进行方差分析、Duncan 新复极差法检验。

3 结果与分析

3.1 水浴提取单因素试验结果与分析

3.1.1 乙醇体积分数对黄酮提取的影响

当乙醇体积分数低于60%时，提取的总黄酮平均含量随着乙醇体积分数的增大而升高；当乙醇体积分数为60%时，提取的总黄酮平均含量达到最大；当乙醇体积分数大于60%时，提取的总黄酮平均含量随着乙醇体积分数的增大而降低。因此，提取黄酮时，乙醇的体积分数应当控制在60%左右[3]。

3.1.2 固液比对黄酮提取的影响

当固液比大于或等于1：25时，提取的总黄酮平均含量随着固液比的减小而升高，固液比小于1：25时，随着固液比的减小，提取的总黄酮平均含量几乎没有变化。因此，在提取黄酮时，最好将固液比控制在1：25左右。

3.1.3 提取时间对黄酮提取的影响

提取的总黄酮平均含量随着提取时间的延长而升高，当提取时间超过1.5h时，提取的总黄酮平均含量基本没有变化。因此，在提取黄酮时，最好将提取时间控制在1.5h 左右。

3.1.4 提取温度对黄酮提取的影响

当提取温度小于60℃时，提取的总黄酮平均含量随着提取温度的升高而升高；当提取温度为60℃时，提取的总黄酮平均含量达到最大；当提取温度大于60℃时，随着提取温度的升高，提取的总黄酮平均含量逐渐降低。因此，在提取黄酮时，最好将提取温度控制在60℃左右。

3.2 水浴提取正交试验结果与分析

该正交试验结果及方差分析的结果表明，乙醇体积分数、固液比、提取时间、提取温度对黄酮提取均有极显著的影响，影响程度依次为：固液比＞乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间。通过单因素和处理组合间的多重比较结果综合分析，可以确定提取竹叶黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数为70%，固液比为1：25，提取时间为1.0h，提取温度为70℃。

4 不同竹种黄酮含量的研究

4.1 材料

4.1.1 试验材料

毛竹、慈竹、孝顺竹、斑竹的一年生长成叶。

4.1.2 主要药品与试剂

同第一章1.2。

4.1.3 主要仪器与设备

同第一章1.3。

4.2 方法

4.2.1 准备工作

采取慈竹、孝顺竹、斑竹叶，其它同第一章2.1。

4.2.2 标准曲线的制定

标准回归方程同第一章2.2。

4.3 竹叶黄酮的提取与测定

4.3.1 竹叶黄酮提取液的制备

取竹叶（慈竹、孝顺竹、斑竹）粉末为原料，采用正交试验优选所得工艺条件和第一章2.3.1的方法进行提取。

4.3.2 竹叶黄酮的测定

同第一章2.3.2。

5 结果与分析

在第一章所得的竹叶黄酮提取最佳工艺条件下，测得不同竹种的竹叶总黄酮平均含量(mg/g)依次为：斑竹19.245＞毛竹18.264＞孝顺竹6.562＞慈竹4.816，慈竹、孝顺竹的竹叶黄酮含量较低，可利用性较低；而斑竹、毛竹的竹叶黄酮含量较高，可利用性较强。

6 总结与讨论

（1）竹叶黄酮提取的最佳工艺条件为：乙醇体积分数ψ=70%，固液比为1：25，提取时间t=1.0h，提取温度T=70℃。

（2）对竹叶黄酮提取影响最大的是固液比，其次是乙醇体积分数，再次是提取温度，影响最小的是提取时间。因此，在进行竹叶黄酮提取时，必须注意各工艺参数的调控，特别是对竹叶黄酮提取率影响最大的固液比。

（3）在各竹种中，斑竹、毛竹的竹叶黄酮含量较高，可利用性较好。建议充分利用其这一特点，加强对斑竹和毛竹竹叶黄酮的利用，提高斑竹和毛竹资源的利用率。

（4）本次研究所得出的结论具有很好的实用性和可操作性，有利于规模化生产，可以实现产业化，但由于所研究的竹种相对较少，也存在一定的不足，以期进一步完善。