SNTB1基因多态位点与四川地区汉族人群高胆固醇血症的相关性分析

杨驭媒，马 誓，毛元英，张 可，李新丽

(1.成都市第六人民医院检验科，四川 成都 610051；2.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072)

高胆固醇血症在发展中国家和发达国家都是非常严重的健康问题，也是动脉粥样硬化和心脑血管疾病的重要危险因素[1，2]。随着生活水平的提高，我国国民生活习惯也发生改变，心脑血管疾病的发病率也越来越高，而血总胆固醇(Total cholesterol，TC)水平升高被认为是冠心病死亡率增加的独立危险因素[3]。高胆固醇血症的发生是由环境因素(包括吸烟、运动、饮食等)和遗传因素共同作用[4]。最近的研究发现，ABCA1基因上多态位点与血脂水平相关[5～7]。SNTB1基因编码蛋白β1-syntrophin(β1互养蛋白)与ABCA1相互结合所形成的复合体对胆固醇代谢具有调控作用[8]。因此，本文选取SNTB1基因上3个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位点，通过病例-对照关联研究分析其与四川地区中国汉族人群高胆固醇血症的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象2013年5月至2018年1月，成都市第六人民医院和四川省人民医院的门诊和住院患者以及健康体检人群，年龄40～75岁，有严重疾病可能影响长期生存的参加者被排除。高胆固醇血症定义根据2007年中华心血管病学会制定的《血脂异常防治建议》标准：血浆总胆固醇水平≥5.2 mmol/L[9]，问卷调查包括吸烟、家族史等。医院伦理委员会批准本项研究，研究对象均签署知情同意书。均为四川地区汉族人群。

1.2生化检测血浆葡萄糖(GLU)、甘油三脂(TG)、TC、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的测定：所有受试者空腹(8小时以上)采集静脉血；所有检测均在成都市第六人民医院检验科进行。

1.3基因组DNA提取将收集的5 ml人外周血离心去除血清；接着加入0.2%NaCl溶液，轻轻振荡5～6次，放置于冰上15分钟，2500 rpm离心30分钟，收集沉淀物；用0.2%的NaCl溶液洗涤一次；加入10 mMTris-HCl(pH8.0)和10 mM EDTA(4 m1)，10%SDS，25 mg/ml的蛋白酶K和10 mg/ml的RNaseA，其加入量分别为4 ml、16 μl和20 μl，上下颠倒混匀，37 ℃过夜温育；过夜后，加入4 ml酚/Tris溶液，上下颠倒混匀，3000 rpm离心10分钟，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加l/10，3 M NaAC (pH 5.2)，两倍体积的无水乙醇，使DNA沉淀；用70%的乙醇洗涤以获得基因组DNA；溶解于TE中，然后定量测定在260 nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至50 ng/μl，置-20 ℃冰箱保存。

1.4PCR扩增针对SNTB1基因上3个标签SNP位点(rs7839488、rs4395927和rs4455882)，通过NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)获得基因组序列，采用Primer 3.0在线软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成(PCR引物序列见表2)。反应体系10 μl，其中DNA模板1.0 μl，上下游引物0.3 nmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，Taq酶0.2 μl，MgCl21.5 mmol/L，ddH2O补充至10 μl。PCR反应程序为95 ℃预变性5分钟，35个循环(94 ℃变性30秒，57 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒)，然后72 ℃延伸7分钟。

1.5基因分型采用单碱基延伸法(SNaPSHOT)。首先进行PCR产物纯化：PCR产物3 μl，加入SAP 2 μl，ExoI酶0.1 μl，SAP 10×Buffer 0.1 μl，ddH2O补充至10 μl；纯化反应程序为：37 ℃ 1小时，75 ℃ 15分钟。第二步进行SNaPSHOT反应：SNaPSHOT MULTIPLEX 1μl，纯化好的PCR产物1 μl，SNAPSHOT引物(引物序列见表1)0.2 μl，ddH2O补足5 μl；反应程序：96 ℃ 1分钟，25个循环(96 ℃ 10秒，50 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒)。第三步为第二次纯化：上一步反应产物中加入SAP 1.0 μl，程序：37 ℃ 1小时，75 ℃ 15分钟。最后取上述产物1 μl加入9μl HD，混匀后上ABI 3730XL测序仪检测基因型，Genemap软件读取基因分型情况。

1.6统计学方法所有数据分析使用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差表示，组间分析采用t检验。Hardy-Weinberg 平衡、等位基因频率的组间比较采用χ2检验，应用多因素回归分析SNP位点与高胆固醇血症的相关性，校正年龄、性别、吸烟史，单倍型分析采用Haploview 4.2软件。P< 0.05为差异有统计学意义。

表1 SNTB1基因SNP位点引物序列情况

2 结果

2.1两组基本情况比较如表2所示，本研究中高胆固醇血症(HTC)组766例(男391例)，正常对照(NC)组913例(男456例)。HTC组体重、血压、血糖、总胆固醇及血脂水平均显著高于NC组(P< 0.05)。

表2 两组基本情况统计

*与NC组比较，P< 0.05

2.2SNTB1基因SNP位点与高胆固醇血症相关性分析SNTB1基因3个SNP位点的基因型分布在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05，表3)，说明本研究资料具有群体代表性。其等位基因频率在病例组和对照组之间具有显著差异(rs7839488P= 0.0026，rsrs4395927P= 0.00014，rs4455882P= 0.0045，表3)，风险等位基因可以增加对高胆固醇血症的易感性(OR值分别为1.28、1.36、1.25)，见表3。

表3 SNTB1基因3个SNP位点在病例和对照组中风险等位基因频率比较

* HWE：Hardy-Weinberg平衡；**P值和OR值为校正年龄、性别等参数之后的结果。

2.3连锁不平衡和单倍体型分析采用Haploview 4.2 软件对SNTB1基因3个SNP位点进行分析，结果显示，这3个SNP位点均处在同一个连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)区域(图1)。这3个位点可组成6个不同的单倍体型，其中风险单倍体型GCA可增加高胆固醇血症患病风险34%(P= 0.00035)，而保护型单倍体型ATG可降低患病风险24%(P= 0.0021)。见表4。

图1 SNTB1基因3个SNP位点连锁不平衡图 图中方块的颜色深浅代表SNP位点之间的连锁紧密程度。a：方块中数字显示的是SNP位点之间的D’值；b：方块中数字显示的是SNP位点之间的r2值

表4 SNTB1基因3个SNP位点的单倍体型分析

3 讨论

本研究基于遗传因素基因多态性，研究SNTB1基因与高胆固醇血症发病的关联。结果发现，SNTB1基因上3个SNP位点(rs7839488、rs4395927和rs4455882)与四川地区汉族人群高胆固醇血症发病显著相关。

SNTB1基因位于染色体8q24.12区域，编码β1互养蛋白(β1-syntrophin)，属于互养蛋白家族成员之一。互养蛋白家族与抗肌萎缩蛋白(dystrophin)复合物信号通路以及离子通道相关，在多个细胞信号通路受体的激活过程中起作用[10，11]。研究显示，β1互养蛋白与ABCA1在人成纤维细胞相互结合，影响ABCA1的表达，并调控胆固醇代谢[8]。ABCA1(脂质转运膜蛋白1，ATP-binding cassette transporter 1)属于ABC蛋白家族，可介导胆固醇流逝并调节新生HDL的形成[12]，在胆固醇逆转运过程中起着非常重要的作用[13，14]。ABCA1基因上多态位点可以影响其转录和蛋白表达水平，从而引起脂代谢紊乱[15，16]。

结合这些功能研究的结果和遗传学发现以及我们的实验结果，说明SNTB1基因多态位点有可能通过调控其转录和基因表达，使得其编码蛋白-β1互养蛋白的水平发生改变，进而影响与ABCA1的结合，参与胆固醇代谢的调节，从而影响高胆固醇血症的易感性。由此可见，进一步深入研究SNTB1基因上这些SNP位点在其表达过程中的具体调控作用模式，以及SNTB1编码蛋白的功能，对于我们认识高胆固醇血症的发病机制具有重要意义，同时也将有助于疾病的早期诊断、预防和靶向治疗。