WISP-1对单侧输尿管梗阻小鼠肾脏纤维化的作用研究

钟 翔，杨 雪，2，涂月菊，李 怡，张 萍，邹玉蓉，李贵森，王 莉

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院肾内科，四川 成都 610072；2.西南医科大学，四川 泸州 646000)

肾纤维化是各种慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)进展至终末期肾脏病(end-stage renal disease，ESRD)的共同表现，是影响患者肾功能和肾脏预后的主要指标。目前临床实践中仍然缺乏有效的肾脏纤维化干预措施。WNT1诱导信号通路蛋白1(WNT1-inducible signaling pathway protein-1，WISP-1)也称为CCN4，是一种富含半胱氨酸的分泌性蛋白多肽。研究证实，WISP-1通过增强细胞粘附、促进细胞迁移和刺激细胞增殖等方法[1，2]，参与肺脏[3]，心脏[4]和肝脏[5]等器官的纤维化，但它在肾脏纤维化中的具体作用仍然未知。因此，本研究旨在探讨WISP-1在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾脏纤维化中的作用，为肾纤维化的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1动物模型制备与干预2015年9月至2017年6月体重20～25 g的雄性C57BL/6清洁小鼠(10周)购自四川省人民医院实验动物中心。首先参考课题组以前实验方法制作UUO模型[6]。将5 μg的小鼠WISP-1/CCN4亲和纯化多克隆抗体(Pab)(AF1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)和5 μg的小鼠WISP-1/CCN4单克隆抗体(Mab)(MAB1680，R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)通过腹腔注射到UUO小鼠作为处理组(UUO+Ab)；同时将纯化大鼠IgG(6-001-A，R&D Systems，Minneapolis，MN，美国)注射入UUO小鼠腹腔作为对照组处理组(UUO+IgG)；单纯行UUO手术小鼠作为模型组(UUO)；随机选择年龄体重匹配正常小鼠作为正常组(Normal)；每组均为10只。将所有小鼠饲养于控制环境条件下(23 ℃)具有12小时明暗周期的房间中，在UUO手术后第7天麻醉处死所有小鼠并收集梗阻侧肾组织。该实验经四川省人民医院医学伦理委员会批准(伦理编号：2013自科(04)号)。

1.2肾脏病理和免疫组织化学染色在UUO手术后第7天处死小鼠后，取出梗阻侧肾脏并用4%多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中。制备3 μm的肾脏切片，并使用苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色，高碘酸-雪弗(periodic acid-Schiff，PAS)染色和Masson三色染色评估肾脏病理学变化。免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色在常规脱蜡水化后，使用高温高压进行抗原修复。一抗包括抗WISP-1 (ab178547，Abcam，剑桥，英国)、抗胶原蛋白I(抗 Collagen I，ab34710，Abcam，剑桥，英国)4 ℃过夜后，室温孵育二抗1小时，使用DAB进行显色，显微镜下控制显色时间。靶蛋白的阳性染色区域使用ImageJ软件(NIH)测量，结果表示为检测区域的百分比。

1.3蛋白质免疫印迹分析在液氮中研磨小鼠肾脏组织后，使用RIPA缓冲液在冰上裂解组织，超声后13000×g 10分钟离心提取上清液。蛋白样品电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭1小时。将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，然后在室温下二抗孵育2小时。ECL试剂显影，并用Image Quant LAS4000微型系统捕获。使用ImageJ软件定量分析蛋白质印迹的变化。

1.4统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料比较采用单因素方差分析及SNK法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1常规病理染色显示抗WISP-1治疗改善UUO小鼠肾组织纤维化的形态学改变常规病理染色包括HE，PAS和Masson三色染色显示对比正常小鼠组，UUO组和UUO + IgG组小鼠肾组织出现不同程度肾间质纤维化、肾小球硬化和胶原纤维及细胞外基质沉积，表明造模成功。在WISP-1抗体干预后，UUO + Ab组上述病理变化显著减轻(图1)，表明抗WISP-1治疗从肾组织形态学上改善UUO小鼠肾组织纤维化。

2.2免疫组化染色显示抗WISP-1治疗减轻UUO小鼠肾组织肾纤维化的表达采用IHC来检测各组小鼠肾脏WISP-1和纤维化标志物胶原蛋白I(Collagen I)的表达。如图2a所示，在UUO组和UUO + IgG组的肾组织中，WISP-1主要在肾小管间质表达，少量在肾小球中表达，UUO + Ab小鼠肾组织WISP-1表达明显降低，表明抗WISP-1抗体能有效阻断WISP-1在肾脏表达。同时抗WISP-1治疗后Collagen I的染色强度显著降低。进一步采用半定量分析，结果显示抗WISP-1治疗能有效降低WISP-1和肾组织纤维化，各组之间差异有统计学意义(图2b)。

图1 各组肾组织常规病理染色(×400)

图2 各组肾组织免疫组织化学WISP-1和Collagen I染色 a：各组肾组织的WISP-1和纤维化指标Collagen I的免疫组织化学染色(×400)；b：各组肾组织的WISP-1和纤维化指标Collagen I的免疫组织化学染色半定量结果比较。与Normal组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与UUO组比较，#P < 0.05

2.3WB显示抗WISP-1治疗降低UUO小鼠肾组织肾纤维化的蛋白表达本研究同时提取了各组小鼠肾组织蛋白质来检测WISP-1和肾脏纤维化指标Collagen I的表达水平。如图3 a所示，抗WISP-1抗体处理组后WISP-1 蛋白水平降低，表明抗WISP-抗体成功抑制UUO小鼠梗阻侧肾脏中的WISP-1表达。而纤维化标志物Collagen I的蛋白表达在WISP-1抗体干预处理后也显著降低。相反，UUO+IgG组的纤维化标志物和WISP-1表达相比UUO组无明显改变。半定量分析各组差异有统计学意义(图3b)。

图3 各组肾组织蛋白质免疫印迹分析 a：各组肾组织的WISP-1和纤维化指标Collagen I的蛋白质免疫印迹；b：各组肾组织的WISP-1和纤维化指标Collagen I的蛋白质免疫印迹半定量结果比较。与Normal组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与UUO组比较，##P < 0.01

3 讨论

无论CKD最初病因是什么，纤维化都被认为是各种CKD进展至ESRD的共同通路。肾脏纤维化的发生发展极其复杂，是多种细胞和细胞因子的相互作用导致细胞外基质在损伤的肾脏组织中累积并形成永久性瘢痕组织，最终导致肾功能丧失[7]。

研究表明Wnt/β-catenin信号通路在纤维化中起着重要作用[8]。WISP-1是Wnt/β-catenin信号通路的下游分子，，在心脏、肾脏、肺脏、胎盘、卵巢、小肠、脾和脑等多种组织中表达[9]。研究报道，在冠状动脉左前降支永久性闭塞小鼠模型中，WISP-1在边界区和非缺血性遥远区上调，并刺激心脏成纤维细胞增殖[4，10]。通过激活αvβ5整合素，PI3K，Akt和NF-κB通路，WISP-1促进了滑膜纤维化[11]。研究表明，WISP-1增强了肝星状细胞的增殖，阻断WISP-1后，肝脏中胶原的形成和α-SMA的表达明显减少[5，12]。此外，在肺纤维化小鼠模型和特发性肺纤维化患者中，肺泡上皮II型细胞中WISP-1的表达增加，并且特异于WISP-1的中和单克隆抗体减少了纤维化特征性基因的表达[3]。我们的前期研究首次发现[13]，WISP-1的表达不仅在TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞纤维化和UUO小鼠模型中升高，而且在CKD患者包括局灶增生性IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)，局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomurular sclerosis，FSGS)和糖尿病性肾病(diabetic kidney disease，DKD)的肾脏组织和血清中明显升高。然而，WISP-1在肾脏纤维化中的功能尚未有研究报道。因此，本研究采用市售抗WISP-1抗体干预WISP-1在UUO模型小鼠体内表达，探索抗WISP-1治疗是否影响UUO小鼠肾脏纤维化。

UUO模型是目前研究肾小管间质纤维化最常用的动物模型，以进行性小管间质纤维化为特征，梗阻时间越长，肾间质纤维化的程度越严重[14]。本研究发现，与正常小鼠比较，无论是在组织学上还是在蛋白的表达上，UUO小鼠在术后第7天均出现显著的纤维化表现，表明UUO模型小鼠造模成功。

本研究采用市售抗WISP-1抗体通过腹腔注射方法干预WISP-1在UUO模型小鼠体内表达。利用WB、IHC证实UUO组及UUO+IgG组小鼠肾脏中的WISP-1表达增加，使用抗WISP-1抗体处理后，UUO+Ab组WISP-1的表达明显降低，证实抗WISP-1治疗可以成功抑制UUO小鼠肾脏WISP-1表达；更重要的是，抗WISP-1抗体组UUO小鼠的肾脏病理、纤维化程度及重要纤维化指标Collagen I均比UUO组和UUO + IgG组明显减轻。这些重要的研究结果表明，通过WISP-1中和抗体的干预可以减轻UUO小鼠中的肾纤维化，提示WISP-1在肾脏纤维化中起致病作用。

本研究成功建立了UUO纤维化小鼠模型，并成功通过抗WISP-1抗体抑制WISP-1在UUO小鼠体内表达。我们研究结果表明WISP-1在肾纤维化中扮演了促进作用，而抗WISP-1抗体治疗可以通过凋亡改善肾纤维化。本研究为肾脏纤维化的治疗提供了新的靶点和途径。