葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠模型肠黏膜内NF-κB、TNF-α、MFG-E8及occludin表达的影响

陈 丽

(四川省安岳县人民医院消化内科，四川 安岳 642350)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种以腹痛、腹泻、粘液血便等为主要临床表现的发生于结、直肠的非特异性炎症疾病[1]。中医将UC归为“泄泻”、“大瘕泻”等范畴，饮食不节、外感湿热之邪、情志失调等因素所致的脾胃虚弱为发病之本，脾胃虚弱则致水谷不化、后天失养，脏腑机能失调以致气血生化无源、运化无力，湿热内蕴、壅滞肠间、搏结气血则致脂络受伤、腐败成疡，发为UC。目前多采用水杨酸类、免疫抑制剂和糖皮质激素治疗UC，取得了一定效果，但存在疗效不稳定、用药时间长、副作用较大等问题[2]。中医对UC有完整的辩证及施治体系，《伤寒论·太阳病脉证并治》中便有以葛根芩连汤主治协热下利的论述[3]。本研究观察葛根芩连汤对UC小鼠的影响，探讨葛根芩连汤对小鼠UC的疗效及治疗机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料雌性balb/c小鼠(川北医学院动物实验中心)40只，均为无特定病原体级(SPF)，体重18～20 g，6～7周龄。葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium，DSS，北京联立信生物技术有限公司)。葛根芩连汤：葛根15 g，黄芩、黄连各9 g，甘草6 g。柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SSZ，上海中西三维药业有限公司，规格：0.25 g，批准文号：国药准字H31020450)。兔抗鼠Anti-NF-κBP65多克隆抗体、兔抗鼠Anti-MFG E8/BA 46多克隆抗体、兔抗鼠Anti-OCLN/occludin多克隆抗体、SA1022-兔Ig G SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒，均来自博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Anti-TNF-α多克隆抗体来自博奥森生物科技有限公司。蛋白质抽提试剂盒及PCR提取试剂盒均购自广州英伟创津公司。引物(β-actin)由上海森工及大连宝生物有限公司合成。美国Bio-Tek公司Epoch连续波长酶标仪，National Institutes of Health Image J 2.1.4.7，BIORAD电泳仪，Odyssey CLX红外荧光扫描成像系统。

1.2实验分组及动物模型建立将40只balb/c小鼠分为A组(空白对照组，蒸馏水，n=10)、B组(模型组，DSS+蒸馏水，n=10)、C组(SSZ组，DSS+SSZ，n=10)及D组(葛根芩连汤组，DSS+葛根芩连汤，n=10)。小鼠适应性喂养7d后，除A组外，B、C、D各组小鼠均连续7 d予以5%DSS(分子量36000～50000)溶液代替饮用水供其自由饮用，隔天更换一次。造模同时相应药物灌胃或予以蒸馏水，剂量3 μg/g·d，持续7 d。

1.3观察及取材每日观测、记录的小鼠的体重、大便性状和便血情况，记录疾病活动指数(DAI)评分[4]，评分标准：包括体重下降、大便性状、出血3个方面，体重下降0%、1%～5%、5%～10%、10%～15%、>15%分别记0～4分，大便性状正常、松散、稀便分别记0、2、4分，大便隐血正常、隐血阳性、肉眼血便分别记0、2、4分；DAI=体重下降+大便性状+出血得分。第8 d采取颈椎脱臼法处死各组小鼠。剖开小鼠腹部，迅速取出整个结肠段，测定结肠长度及湿重，观察结肠充血、水肿、大便团分布等情况，解剖出小鼠脾脏，计算脾指数。取材1：于距结肠末端5 mm或10 mm处横切切取一段5 mm左右直肠，纵行剖开于PBS液漂洗2次，然后经液氮罐转入-70 ℃冰箱保存，用于分子生物学检测；其余结肠浸润固定于10%的福尔马林溶液中，24 h后转入70%保存(4 ℃)。取材2：对于固定后的结肠，首先把另一段直肠(5 mm长，距肛门5 mm或10 mm)横切成等高的2段，包埋于石蜡中。其余剩下的近胃端结肠则等距随机取2块(横切，碰到大便位置在大便旁边切)，包埋在一起。

1.4病理组织学检测取结肠组织石蜡块行4 μm连续组织切片，烤片，HE染色，光镜下观察结肠组织病理损伤，并进行组织损伤评分[5]。

1.5免疫组化法检测将结肠组织石蜡块行3 μm连续切片，置于58～60 ℃烤箱中30～60 min，使切片组织紧密粘附于过多聚赖氨酸处理后的载玻片，实验步骤为切片脱蜡、脱水、灭活、抗原修复、封闭、滴加一抗、冲洗、DAB显色、复染、脱水、透明、封片。采用Image J 2.1.4.7软件测量免疫组织化学图像平均灰度值，NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin等阳性物质平均灰度值越低提示其含量越高。

1.6结肠黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白表达定量检测取结肠组织，液氮研磨，加RAPI裂解液，置于冰上，超声组织破碎仪提取蛋白，10 min后，12000 rpm/min离心15 min，取上清液，采用Western-bloting技术定量检测NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin的表达情况。

1.7统计学方法采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用F检验及SNK-q检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DAI评分、组织损伤评分及病理形态学观察

B、C、D组建模第7d时DAI评分、建模第8d时组织损伤评分均大于A组，且B组大于C、D组(P< 0.05)；C、D组上述评分比较，差异无统计学意义(P> 0.05)。见表1。A组镜下可见肠黏膜、腺体结构层次清楚、完整，无或极少炎症细胞浸润(图1a)。B组镜下可见肠黏膜组织细胞、腺体结构遭受不同程度破坏，层次结构不清，排列紊乱，伴广泛炎症细胞浸润，主要累及黏膜和黏膜下层(图1b)。C组镜下可见肠黏膜组织细胞、腺体结构遭受破坏程度显著较B组轻，浸润的炎症细胞数量显著较B组少，黏膜结构有不同程度恢复(图1c)。D组镜下可见肠黏膜组织细胞、腺体结构遭受破坏程度与C组相近，浸润的炎症细胞数量显著较B组少，黏膜结构有不同程度恢复(图1d)。

表1 四组DAI评分、组织损伤评分比较 (分)

a与A组比较，P < 0.05；b与B组比较，P < 0.05

图1 各组小鼠病理形态学观察(HE染色) a：A组； b：B组； c：C组； d：D组

2.2结肠长度、结肠质量及脾指数建模第8 d时，A、C、D组结肠长度大于B组，结肠质量、脾指数小于B组(P< 0.05)；且A、C、D上述指标检测结果比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，见表2。

表2 四组结肠长度、结肠质量及脾指数比较

a与A组比较，P < 0.05；b与B组比较，P < 0.05

2.3结肠黏膜免疫组织化学图像观察及NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比较建模第8d时，四组结肠黏膜NF-кB、TNF-α平均灰度值水平均显示A>C>D>B，MFG-E8、occludin平均灰度值水平均显示A

图2 NF-кB免疫组化图 a：阴性对照图；b：A组；c：B组；d：C组；e：D组

表3 四组结肠黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比较

a与A组比较，P < 0.05；b与B组比较，P < 0.05；c与C组比较，P < 0.05

图3 TNF-α免疫组化图 a：阴性对照图；b：A组；c：B组；d：C组；e：D组

图4 MFG-E8免疫组化图 a：阴性对照图；b：A组；c：B组；d：C组；e：D组

图5 occludin免疫组化图 a：阴性对照图；b：A组；c：B组；d：C组；e：D组

2.4结肠黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白相对表达情况建模第8d时，四组结肠黏膜NF-кB、TNF-α蛋白相对表达量均显示AC>D>B，差异均有统计学意义(P< 0.05)，见表4。

表4 四组结肠黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin表达情况比较

a与A组比较，P < 0.05；b与B组比较，P < 0.05；c与C组比较，P < 0.05

3 讨论

近年UC发病率随人们饮食结构的改变和生活水平的提高呈上升趋势，且UC易反复发作，多迁延日久，易对患者身心健康造成严重影响[6]。UC的发病机制尚未阐明，相关研究显示其与炎症反应、肠道屏障功能缺陷和菌群失调等因素有关[7]。

常规水杨酸类、免疫抑制剂和糖皮质激素治疗虽取得了一定效果，但存在疗效不稳定、用药时间长、副作用较大等问题[8]。葛根芩连汤作为中药汤剂，可针对UC患者脾胃虚弱为本，湿热内蕴、痰湿停滞、瘀血阻滞为标的主要病理特点，提出了外疏内清、表里同治的治疗方法[9]。本研究中，予葛根芩连汤的D组UC小鼠DAI评分、组织损伤评分均低于未予治疗的B组，且上述评分与予SSZ的C组差异无统计学意义，结肠长度、结肠质量及脾指数与A组差异无统计学意义，提示葛根芩连汤对减轻UC小鼠病变程度和结肠组织损伤范围有一定帮助。

脾主运化、统血，正常情况下，机体脾气健运，机体消化吸收、水谷精微输布功能健全，从而维持正常的生理活动。UC患者因患病日久湿毒瘀滞、情志内伤等因素而正虚邪实，脾气不足则致脾失健运，水谷不运，气血生化无源，使患者出现消瘦乏力、面色无华、泄泻等症。同时，脾气不足亦可致中气下陷，内脏下垂，引起肛门坠胀等症。方中以葛根为君，辛甘而凉，入脾胃经，既能解表退热，又可轻清升散，升举脾胃清阳之气，使津液布行，止泻止痢。黄连、黄芩共为臣药，行清热燥湿、泻火解毒、厚肠止利之功，有效改善UC所致湿热中阻、痞满、泻痢等症。药理研究显示，葛根芩连汤具有良好的解热、抗菌、抗病毒、抗氧化应激、解痉及增强免疫作用[10]，适用于对UC的治疗。

文献显示，Toll样受体(TLRs)/NF-κB信号传导通路参与了UC发病机制，在调节涉及黏膜炎症反应中起核心作用[11]。NF-κB抑制因子磷酸化IκB炎症信号刺激下被泛素化降解，从细胞膜向细胞核转位，调控C-MYC、CDK1等下游相关靶基因释放，参与细胞周期、凋亡、癌变。TLRs/NF-κB的过度激活亦将导致TNF-α、IL-6、IL-8等炎症介质的过度表达，引起炎症反应，造成肠黏膜屏障的损伤。TNF-α可诱导白细胞粘附分子的表达使白细胞募集，诱导免疫细胞的增殖和分化，产生一氧化氮分子，并可激活NF-κB，形成恶性循环，直接或间接导致肠黏膜屏障损伤[12]。MFG-E8作为一种亲脂性糖蛋白，可使损伤的肠黏膜上皮细胞在其促肠上皮细胞迁移作用下加速修复，并可与磷脂酰丝氨酸结合，诱发溃疡边缘肠上皮细胞肌动蛋白细胞骨架的重构[13]。occludin蛋白则是构成肠黏膜上皮细胞间紧密连接的主要蛋白，对阻止有害物质渗入黏膜下层有重要意义，因此其表达情况可反映黏膜屏障功能的变化[14]。本研究中，予以葛根芩连汤治疗的D组UC小鼠结肠黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值、蛋白相对表达量改善情况虽不及予以SSZ治疗的C组，但显著均优于未予以治疗的模型组，提示该中药汤剂对改善肠道炎症反应、促进肠黏膜修复有一定帮助。祁燕等[15]采用具有健脾胜湿、清热解毒的中药汤剂治疗UC小鼠，发现其可有效减轻炎症反应，促进肠黏膜修复，与本研究基本一致。

综上所述，葛根芩连汤可减轻UC小鼠病变程度和结肠组织损伤范围，改善肠道炎症反应，促进肠黏膜修复，对UC治疗有重要意义。