辛通畅络法对膜性肾病*小鼠基质金属蛋白酶-9及肿瘤坏死因子-α的影响

★ 王学军 吕艳 支勇 曹式丽（天津中医药大学第一附属医院肾病科 天津 300193）

1 材料

1.1 实验动物 远交系健康雄性Balb/c小鼠（8周龄），SPF级，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供（许可证号：SCXK京2016-0002），其中MMP-9基因敲除小鼠由上海吉凯基因公司制备。

1.2 实验试剂 阳离子化牛血清白蛋白（Chondrex公司）；弗氏不完全佐剂（Sigma公司）；MMP-9（武汉博士德生物工程有限公司）；TNF-α（尚柏生物医学技术北京公司）。

1.3 实验药物 肾络宁：由柴胡、黄芩、生黄芪、当归、女贞子、泽兰、水蛭、细辛等组成，方药经煎煮浓缩成100mL汁液（含生药1.05g/mL）。药物购自天津中医药大学第一附属医院中药房，加工由天津中医药大学药厂协助完成。

2 方法

2.1 动物分组 实验小鼠共40只适应性饲养1周后，按体重分层随机分为MMP-9基因敲除组、肾络宁组、模型组各10只，各组均制备膜性肾病模型，余下10只作为空白对照组。实验全程给予普通饲料喂养，自由进水。

2.2 模型复制 参考有关文献复制采用阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）制备heymann膜性肾病小鼠模型［4］。预免疫：C-BSA 1mg，加入 0.5mL PBS中，再同等量的弗氏不完全佐剂混匀配制成乳白色悬浊液，在小鼠双侧腋下、腹股沟作多点皮下注射进行预免疫。正式免疫：预免疫1周后，每只小鼠尾静脉注射C-BSA 2.5mg（溶于lml pH值为7.4的PBS中），每周2次，共2周。

2.3 给药方法 基因敲除组、肾络宁组，自造模第1天起灌服肾络宁（13.65g/kg）；模型组、对照组以等量生理盐水灌胃。实验共进行6周。

2.4 检测指标与方法 于给药后0周、第6周末检测尿蛋白浓度；于给药第0周自小鼠眶后静脉窦取血，第6周末小鼠股动脉取血，离心血清，进行MMP-9、TNF-α的检测。

2.5 统计学分析 应用 SPSS13.0统计软件，各组实验数据均以平均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析对实验结果进行统计学分析。

3 结果

3.1 尿蛋白的变化 实验前各组小鼠尿蛋白无统计学差异（P＞0.05），第6周末模型组、肾络宁组与基因敲除组小鼠尿蛋白均有不同程度明显增加，肾络宁组、基因敲除组小鼠尿蛋白明显低于模型组（P＜0.05），且基因敲除组明显低于肾络宁组（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组小鼠尿蛋白的变化（，n=10） mg/L

表1 各组小鼠尿蛋白的变化（，n=10） mg/L

注：与正常组比较，●P﹤0.05，●●P﹤0.05；与模型组比较，○P﹤0.05。

组别 0周 6周正常组 371.87±48.84 569.77±117.30模型组 359.08±16.60 1288.55±149.25●●肾络宁组 366.24±81.00 824.74±94.62●○基因敲除组 327.44±27.08 916.51±82.18●○

3.2 血清MMP-9的表达 实验前正常组、模型组及肾络宁组小鼠MMP-9表达无统计学差异（P＞0.05），而MMP-9基因敲除组MMP-9表达明显降低（P＜0.01），第6周末模型组、肾络宁组与基因敲除组小鼠MMP-9表达均有不同程度增加，肾络宁组、基因敲除组明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），而肾络宁组、基因敲除组间无统计学差异（P＞0.05）。见表 2。

表2 各组小鼠MMP-9的变化（） ng/mL

表2 各组小鼠MMP-9的变化（） ng/mL

注：与正常组比较，●P﹤0.05，●●P﹤0.01；与模型组比较，○P﹤0.05，○○P﹤0.01。与肾络宁组比较，▼▼P＜0.01。实验中因溶血致基因敲除组剔除1只。

组别 例数 0周 6周正常组 10 3.16±0.71 3.02±0.95模型组 10 2.89±0.69 4.98±0.91肾络宁组 10 2.67±0.56 3.88±0.04○基因敲除组 9 0.84±0.05●●○○▼▼ 1.86±0.13●○○▼▼

3.3 血清TNF-α的表达 实验前正常组、模型组及肾络宁组小鼠TNF-α表达无统计学差异（P＞0.05），第6周末模型组、肾络宁组、基因敲除组TNF-α表达均匀不同程度升高，其中肾络宁组、基因敲除组低于模型组（P＜0.05），而肾络宁组、基因敲除组间无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组小鼠TNF-α的变化（） pg/mL

表3 各组小鼠TNF-α的变化（） pg/mL

注：与正常组比较，●P﹤0.05；与模型组比较，○P﹤0.05。实验中因溶血致基因敲除组剔除1只。

组别 例数 0周 6周正常组 10 6059.36±1618.51 5617.87±704.88模型组 10 6170.74±848.94 9339.85±2469.29●肾络宁组 10 6164.59±1605.22 7208.41±820.96●○基因敲除组 9 5939.25±431.36 7707.81±916.08●○

4 讨论

MN是原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，其病理以肾小球基底膜上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉积，肾小球基底膜（GBM）增厚，肾小球滤过膜屏障的完整性受到破坏，从而出现大量蛋白尿。我们认为MN的中医病机关键为“少阳枢机不利，肾络郁滞，虚实错杂”，并在长期临床基础上制定了以“疏利少阳、辛通畅络”为法的肾络宁中药复方制剂，方中柴胡、黄芩疏利少阳，枢转气机；黄芪、当归益气补血，扶正理虚；细辛、水蛭辛通畅络，化瘀消滞。诸药协同，疏导调节，养脏和络，促进肾络气血调畅。本实验结果提示肾络宁能够有效减少MN小鼠尿蛋白排泄，改善蛋白质代谢，提高血清蛋白水平。

在MN肾小球GBM病理过程中，MMP-9和TNF-α发挥重要作用。MMP-9是胶原酶，主要降解基膜胶原（Ⅳ型胶原），而Ⅳ型胶原是构成GBM 最基本的骨架， MMP-9是导致肾小球基底膜IV型胶原的结构和功能发生改变，引起肾小球滤过屏障功能障碍，进而产生大量蛋白尿的重要病理因素［5-6］，研究证实MMP-9参与了Heymann肾炎GBM 中Ⅳ型胶原的降解，导致GBM的破坏，且MMP-9的活性与肾小球GBM损伤程度相平行［7-8］，国内临床研究表明原发性膜性肾病患者肾组织MMP-9的表达明显增强，提示MMP-9在肾脏疾病炎症反应过程中活性增加，导致GBM中Ⅳ型胶原过度降解，促进GBM结构破坏［9］。因此目前认为MMP-9表达增加是引起MN肾小球毛细血管基底膜胶原降解、通透性增加，导致蛋白尿产生的重要致病因素［10］。TNF-α是免疫功能与机体炎性反应的重要调节因子，肾内多种细胞如系膜细胞、内皮细胞均具有产生和释放TNF-α的能力。TNF-α作为促炎症细胞因子可直接造成肾损伤，又可通过促进其他炎性细胞因子的表达，加重肾脏炎性损伤。如TNF-α刺激系膜细胞产生氧自由基分泌过量的过氧化脂质代谢产物，造成肾小球基底膜通透性的改变，导致尿蛋白形成［11］。前期研究显示辛通畅络法中药复方可抑制家兔C-BSA膜性肾炎血中TNF-α的活性，降低肾小球基底膜通透性，减少尿蛋白［12］。本实验结果显示模型组MMP-9表达升高，而肾络宁组和MMP-9基因敲除组MMP-9表达降低，其中MMP-9基因敲除组尤为显著。TNF-α检测结果显示，模型组和MMP-9基因敲除组TNF-α表达升高，而肾络宁组TNF-α表达降低，提示肾络宁减少MN小鼠尿蛋白排泄的作用，可能是通过降低TNF-α的表达，抑制MMP-9活性，达到改善肾小球GBM结构和功能的损害，延缓MN的病理发展进程。