猪大肠杆菌的分离鉴定及其药敏试验

陈敏卿 龙岩市农产品质量安全检验检测中心 福建龙岩 364000

猪大肠杆菌病是由猪致病性大肠杆菌引起的，临床上主要引起仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，在我国各地均有发生，给生猪养殖业带来巨大的经济损失[1-3]。随着生猪规模化养殖的发展及抗生素的大量使用，同时又因大肠杆菌其血清型众多，抗原复杂，具有容易产生变异等特性，大肠杆菌菌株已产生广泛的耐药性和多重耐药性。因此，本试验通过细菌的分离鉴定，并筛选其敏感药物，从而有效的指导临床用药，达到最佳的治疗效果。

1 材 料

1.1 病料及来源 病料来源于福建省某规模化猪场疑似发生大肠杆菌病的仔猪，无菌采集猪淋巴结、肝脏、脾脏、肠内容物、肠系膜淋巴结等病料。

1.2 材料及试剂 营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基购置广东环凯微生物科技有限公司；药敏纸片购置北京天坛药物生物技术开发公司；DNA提取试剂盒、2×EasyTaq PCR Super-Mix等试剂购置全式金生物技术有限公司。

1.3 试验动物 清洁级昆明小鼠购置吴氏实验动物中心。

2 方 法

2.1 细菌分离培养及镜检 将病料接种于营养琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，伊红美蓝琼脂培养基37℃培养18～24 h，将可疑的大肠杆菌菌落接种于营养琼脂平板上，37℃恒温箱中纯化培养12～18 h。挑取单个菌落进行革兰染色，置于显微镜下观察镜检。

2.2 测序鉴定 选用通用引物27F/1492R扩增细菌 16S rRNA。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'，1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反应条件为：94 ℃预变性 5 min、94 ℃变性 40 s、52 ℃复性 40 s、72 ℃延伸 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经纯化和克隆，送往生工（上海）生物工程有限公司进行基因测序，将测序的结果与GenBank中公布的序列进行同源性分析。……