基于网络药理学的当归补血汤治疗贫血的作用机制研究

李 杨，郝俊杰

（成都中医药大学药学院，成都 611137）

当归补血汤出自金元四大家之一李东垣《内外伤辨惑论》，2015版《中国药典》收载了其成药当归补血口服液〔1〕，由黄芪、当归二味中药组成，具有补气生血的功效，为补气生血之基础方。方中重用黄芪大补脾肺之气，以资化源，使气旺血生。配以当归养血和营，主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越所致的各种病症。临床上当归补血汤可用来治疗和改善各种贫血，如肾性贫血、癌性贫血、营养性贫血等〔2-5〕。已有文献从当归补血汤在促进骨髓造血系统重建、对传导通路的调节等方面对其在血液疾病中发挥效用进行了综述〔6〕，但由于中药复方化学成分复杂，通过多成分、多途径、多靶点、协同作用来发挥药效，因此当归补血汤治疗贫血的综合机制仍有待进一步阐明。

网络药理学通过分析基因∕蛋白、疾病、药物等数据库与实验室获得的真实数据，融合系统生物学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，从系统、整体的角度构建多层次网络，去探索药物与疾病间的关联性〔7-8〕。网络药理学通过预测多成分、多途径、多靶点、协同作用的中药复方及配伍作用机制具有天然的优势。本研究利用网络药理学研究方法构建当归补血汤的“疾病-基因-药物”网络，对黄芪与当归配伍治疗贫血的作用机制进行不同层面分析，以期为研究其作用机制及临床应用奠定基础。

1 方法

1.1 数据的建立 通过中药台湾数据库（TDT，http:∕∕tcm.cmu.edu.tw∕）和中药系统药理学分析平台 TCMSP（http:∕∕lsp.nwu.edu.cn∕tcmsp.php）获得黄芪和当归所含的化学成分结构，再依据相似性比较通过中草药活性成分数据库（HIT，http:∕∕lifecenter.sgst.cn∕hit∕）和治疗靶点数据库（TTD，http:∕∕bidd.nus.edu.sg∕group∕cjttd∕）筛选靶点，建立黄芪和当归靶点数据集。通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM，http:∕∕www.omim.org∕）筛选其治疗贫血的基因和蛋白靶点，建立贫血靶点数据集。人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库（http:∕∕dip.doe-mbi.ucla.edu）获得。为了便于统一分析，以上所有靶点均转化成UniProt ID（蛋白编号ID）格式〔9〕。

1.2 网络的构建 为了更合理地阐明当归补血汤中化学成分与贫血靶点之间的关系，我们对其进行网络药理学分析。通过 PPI（http:∕∕www.genome.jp∕kegg∕）分析，将当归补血汤中黄芪和当归的化学成分、成分对应的靶点、贫血对应的靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“化学成分-靶点-疾病”网络。利用Cytoscape 3.6.1软件将以上网络进行可视化分析，每个点的度、接近中心度2个拓扑参数通过CentiScaPe 1.2进行评估，筛选当归补血汤治疗贫血的目的靶点。对筛选出的靶点使用STRING（https:∕∕string-db.org∕）进行蛋白互作关系分析，最后对筛选的靶点使用 DAVID（https:∕∕david.ncifcrf.gov∕）数据库进行KEGG通路分析和使用Cytoscape软件的Blue GO插件进行GO功能分析。

2 结果

2.1 药物靶点和疾病靶点数据的筛选 基于数据库构建方法，共筛选出黄芪中54个化学成分和283个靶点蛋白；当归中91个化学成分和110个靶点蛋白。

2.2 “药物-靶点-疾病”之间交互网络的构建 网络药理学预测出当归补血汤治疗贫血的交互网络，采用不同的形状图形使其可视化后，让我们更清晰直观地看出化合物与疾病靶点之间的网络关系。其中方形代表药物与疾病共同作用的靶点，也是当归补血汤治疗贫血的最重要的靶点蛋白；圆点代表药物与疾病潜在的交互作用靶点；三角形代表当归补血汤中被预测出的活性化合物。见图1。

图1 当归补血汤治疗贫血的“化学成分-靶点-疾病”交互网络

2.3 当归补血汤治疗贫血作用靶点的拓扑参数分析通过对Cytoscape 3.6.1软件整合的“化学成分-靶点-疾病”交互网络分析，得出当归补血汤活性成分关联贫血的89个蛋白靶点。对这些蛋白靶点进行拓扑参数计算。经CentiScaPe对网络中所有点的拓扑参数（度、介度中心度和接近中心度）进行分析，得出3个拓扑参数中位数分别为：4.000 00、0.001 98和0.225 28。在靶点中选择度大于中位数值2倍，介度中心度、接近中心度大于中位数值的靶点共15个，作为当归补血汤治疗贫血的重要靶点蛋白。见表1。筛选出的靶点蛋白互作关系见图2，蛋白相互作用关系表明筛选出当归补血汤治疗贫血的作用蛋白相互关联和调节。通过网络分析发现在上述蛋白中当归补血汤中与一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible）作用的成分最多。见图3和表2～3。

图2 当归补血汤治疗贫血的蛋白靶点互作关系图

2.4 当归补血汤治疗贫血的GO（基因功能）分析为了阐明当归补血汤治疗贫血的生物学功能，对其进行了GO分析。发现主要为细胞周期阻滞调节（regulation of cell cycle arrest），G0到 G1的负调节（negative regulation of G0 to G1 transition）以及γ辐射响应（response to gamma radiation）等。见图4。

表1 当归补血汤治疗贫血筛选的蛋白信息

表2 当归补血汤中当归作用于一氧化氮合酶的成分

表3 当归补血汤中黄芪作用于一氧化氮合酶的成分

图3 当归补血汤中作用于一氧化氮合酶的成分

2.5 当归补血汤治疗贫血的KEGG通路分析 对“2.3”项中筛选出的靶点在KEGG通路富集分析中，筛选出11条当归补血汤治疗贫血的通路。主要包括细胞循环（Cell cycle）、P53信号通路（P53 signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1signalingpathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。见表4。

表4 当归补血汤治疗贫血KEGG通路

3 讨论

图4 当归补血汤治疗贫血GO（基因功能）分析

本研究通过网络药理学分析构建了当归补血汤的“化学成分-靶点-疾病”交互网络图，筛选出当归补血汤治疗贫血的15个共同作用的蛋白。在这些蛋白中，肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A）〔10〕、糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor）〔11〕、一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible）〔12〕、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase 4）和细胞周期调节蛋白（G1∕S-specific cyclin-D1）〔13〕等都与贫血有关。通过其基因功能分析发现主要通过调节细胞周期阻滞调节（regulation of cell cycle arrest），G0到G1的负调节（negative regulation of G0 to G1 transition）等来治疗贫血。据报道当归补血汤可以促进骨髓造血细胞从G0∕G1期进入G2∕M期和S期来改善骨髓抑制小鼠的造血机能，因此调节细胞周期可能是当归补血汤治疗贫血的机制〔14〕。通路富集发现当归补血汤可以通过调节11条通路来治疗贫血，其中细胞循环、P53信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等均有报道在贫血中发挥着重要的作用〔15-18〕。本文从复方作用综合揭示了当归补血汤中黄芪和当归配伍在治疗贫血方面的多维调控作用，为寻找其有效成分和作用机制及临床应用奠定基础。