巴西产死胎的母猪血液中的猪圆环病毒3型全基因组测序分析

摘译自 Tochetto 等， Transboundary & Emerging Diseases． 2017， (2)．

吴好叶， 梁海英，曾智勇*

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

主持国家自然科学基金项目1项，省厅级项目3项；参研贵州省农业科技攻关项目5项，其他各类省厅(局)级项目13项；获“贵州省科学技术进步奖三等奖”3项。先后发表各类学术论文180余篇，其中SCI论文3篇，一级学报论文12篇，核心期刊90余篇；参编养殖技术丛书3册，参编专业类著作2册，参编《畜牧兽医行政管理学》（国家规划教材）。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威远人，博士，贵州大学教授、硕士研究生导师、贵州大学学术骨干，贵州省科技特派员，黑龙江畜牧兽医杂志编委。主要从事动物传染病及病原分子生物学相关研究，以规模化猪场主要病毒性疫病为基础，开展新型疫苗和病原快速检测方法及试剂盒的研发。同时，长期面向猪场开展猪病毒性疫病的抗体监测和病原的快速检测以及规模化猪场疾病防

猪圆环病毒（Porcine circoviruses， PCV）系圆环病毒科圆环病毒属无囊膜的单股负链DNA病毒，根据抗原性和基因型的不同，最初分为猪圆环病毒1型（PCV1）和2型（PCV2），基因组大小约 2 000 bp。2016 年，Phan 等 从 美 国患有心肌炎和多系统炎症的病猪中发现了一种新型猪圆环病毒（PCV3）。就在几乎同一时间，Palinski等（2017）从患有猪皮炎肾炎综合征、繁殖障碍、以及流产胎儿样品中也检测到了PCV3。有趣的是，尽管上述病症与PCV2的感染相似，但在这些研究中都没有检测到PCV2基因组。在中国，Shen等（2017）在确定PCV2、繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和伪狂犬病毒（PRV）均为阴性的表现发热、厌食并患有呼吸系统疾病的仔猪中检测到了PCV3。此外，Ku等（2017）也怀疑PCV3与猪繁殖障碍有关。上述研究报道表明，PCV3在上述病症中可能起着非常重要的作用，在养猪生产中应引起足够的重视。在波兰14个养猪场中，有12个猪场的母猪及3～20周龄猪的血清中均检测到了PCV3。研究从巴西某猪场曾产出数量不等死胎的母猪血液中（1～4头/窝），成功测序了2株PCV3全基因组序列。

实验选择巴西南部的A、B两个猪场作为调查对象，分别采A场3头、B场6头刚产死胎的母猪血液，分别合为1份，共2份；同时分别采集A场5头、B场10头未产死胎的母猪血液，分别合为1份，共2份。对4份混合血样分别用0．22μm滤器过滤后，150 000×g 4 ℃ 离 心 4 h， 沉 淀用核酸酶处理后，使用标准的苯酚法分别提取核酸。以该核酸为模板，使用Φ29 DNA聚合酶，通过多重置换扩增技术（MDA）进行病毒DNA的扩增。用Nextera试剂盒构建DNA文库后，用Miseq v2300试剂盒通过Illumina MiseqTM 平台测序。利用生物信息软件对获得的序列与GenBank 登录的其他23株PCV3的基因序列进行多重比对，使用SDT v．1．2软件分析序列的同源性，使用 MEGA 7．0．18 软件中的 Hasegawa-Kishino-Yano模型和γ分布的最大似然法进行系统发育树的建立。Bootstrap值通过1 000次重复进行计算。使用SplitsTree4软件的PHI测试对25个序列进行重组分析。

通过metaS-PAdes基因汇编程序，总共生成357 306个（猪场A）和459 648个（猪场B）配对末端读长（PE reads），借助Base Space云数据库通过基因组装器对检索到的重叠群进行分析，获得两株大小均为2 000 bp的PCV3基因组序列（A猪 场，PCV3-BR/RS/6，MF079253；B猪 场，PCV3-BR/RS/8，MF079254）。病毒基因组均包含编码复制相关蛋白（Rep）和衣壳蛋白（Cap）2个开放阅读框（ORF）；5'基因间区域含有235个核苷酸，包括一个潜在的茎环结构（茎环基序TAGTATTAC），与先前报道的PCV1和PCV2基因组一致。Rep ORF在5'末端包含一个替代的起始密码子GTC（缬氨酸），在鸟类圆环病毒和最近发现的一种名为Pork NW2/USA/2009的猪病毒基因组中，也发现了这种替代的起始密码子。Rep N端的三个滚环复制基序 I [FTINN]、II [PHLQG]和 III [YCKK]与其他圆环病毒相同。23个参考PCV3序列均检测到了三个额外的功能未知的基序，它们分别是WWDGY（aa 196-200）、DDFYGWVP（aa 209-216）和 DRYP（aa 225-228）。

PCV3-BR/RS/6 (MF079253) 和 PCV3-BR/RS/8 (MF079254)2与其他比较毒株的全基因组核苷酸序列相似性，分别为97．8%和99．8%之间。前者与中国KY075988和KY075986两株的同源性最高，后者与韩国、美国和中国等报道的PCV3基因组同源性最高。Cap和Rep基因的系统进化分析出现类似的结果。目前，无法从病毒起源方面比较PCV3基因组差异，一是可用于比对的完整PCV3基因组数量相对较少；二是在系统进化树分析中，可能人为地对单独序列进行归类。因此，只有可用于比对的PCV3参考序列增多，才能得出比较准确的推断。此外PHI测试结果表明，25个全基因组之间没有发生重组（P = 0．317 4）。

目前，仅在美国、中国、波兰和韩国有PCV3的报道。通过调查，此前南美尚无有关于PCV3的报道。研究从产死胎母猪血液中检测到PCV3，而未产死胎母猪检测结果为阴性，这表明PCV3已在南美流行，同时提示繁殖障碍可能与PCV3感染有关。Palinski等也曾通过定量PCR发现在流产胎儿中PCV3病毒含量较高。目前从猪繁殖障碍母猪、患有猪皮炎肾炎综合征以及呼吸系统疾病的猪中均检测到PCV3，表明该病毒可能与多种疾病的发生有关。研究将有助南美及其他国家研究PCV3感染的分布情况，以及分析PCV3与产死胎之间的关系，尽早确定PCV3的产生机理，分析其与多种疾病的关系，有利于猪业生产以及疾病防控。