慢性鼓膜穿孔动物模型的研究进展

姚旭 黎欢 胡益 黄钧涛 罗琳 沈毅*

1宁波大学医学院（浙江315211）

2宁波大学附属李惠利医院耳鼻咽喉头颈外科（宁波315040）

鼓膜穿孔（Tympanic membrane perforations,TMP）是耳鼻咽喉科临床常见疾病，主要病因包括中耳炎症、外伤以及医源性损伤[1-3]。鼓膜之结构分为三层：外侧上皮层，中间纤维组织层，内侧黏膜层，其中纤维组织层含有放射形和环形纤维，对鼓膜的振动传声功能起着重要作用，故鼓膜穿孔常导致传导性听力损失。虽然多数急性鼓膜穿孔可在数周内自愈，但仍有约20%患者不能愈合，当穿孔迁延不愈达3月以上，可定义为慢性鼓膜穿孔[4,5]。慢性鼓膜穿孔可导致听力下降和中耳反复溢液，甚至可引发颞骨内外并发症（如迷路炎、周围性面瘫和Bezold脓肿等）和颅内并发症（如硬脑膜外脓肿、乙状窦血栓性静脉炎、脑膜炎、脑脓肿和脑疝等）[6,7]，据报道死亡率甚至可高达18.6%[8]。

目前，手术是慢性鼓膜穿孔的主要治疗方式，术中采用移植物修复鼓膜，从而重建中耳的传声结构。临床常用的自体移植材料包括颞肌筋膜和软骨膜，但此类材料均存在自身缺陷，如需术中扩大切口以便取材、再次手术时难以获取、延长手术时间、增加手术费用等[9]。近年来，随着生物医学和组织工程学技术发展，许多新型生物材料和治疗方法不断被报道，有望取代常规手术。在进入临床使用前，这些新材料和新方法的体内安全性及有效性都需行动物实验予以验证。但是，目前尚缺乏一种理想的慢性鼓膜穿孔动物模型，故许多研究仍然使用急性鼓膜穿孔动物模型，而动物急性鼓膜穿孔均能在短期内迅速自愈，故其不适合用于新材料和新方法临床前的检测[10]。由于缺乏理想的动物模型，从而阻碍了慢性鼓膜穿孔治疗的新进展[11]。近期，一些新型慢性鼓膜穿孔动物模型相继被报道，但后续研究发现许多仍为亚急性或延迟愈合的鼓膜穿孔模型[12]。因此，本文将就慢性鼓膜穿孔动物模型的研究进展进行总结。

1 慢性鼓膜穿孔动物模型的造模方法

迄今为止，许多慢性鼓膜穿孔动物模型的造模方法已被报道，这些方法包括化学方法（如丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶和糖皮质激素类药物等）、物理方法（如鼓膜热烧灼法、鼓膜穿孔边缘内折法和鼓膜反复穿孔法等）、或以上两种方法的结合。

1.1 化学方法

1.1.1 丝裂霉素C

丝裂霉素C是一种抗肿瘤药物，通过选择性阻断DNA复制，从而抑制细胞有丝分裂和蛋白质合成。既往研究显示，鼓膜穿孔后予以局部使用丝裂霉素C可延迟鼓膜穿孔的愈合，平均延迟时间为44-84天，但不能成功建立慢性鼓膜穿孔动物模型。有学者发现丝裂霉素C浓度为0.4 mg/ml时为抑制鼓膜成纤维细胞和上皮细胞增殖的最佳剂量，而高浓度丝裂霉素C（2.0 mg/m l）可导致听力受损和耳漏，并且增加丝裂霉素C的使用时间或次数对维持穿孔时间并无统计学差异。Esteban等[13]报道丝裂霉素C和氢化可的松联用8周后穿孔率为62.5%-77.7%，但在他之前，丝裂霉素C联用地塞米松或氢化可的松制备慢性鼓膜穿孔动物模型的成功率为72%-100%[14,15]。

1.1.2 5-氟尿嘧啶

5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种胸苷酸合成酶抑制剂，通过抑制脱氧胸苷酸合成酶,从而影响DNA合成。5-FU能干扰RNA中蛋白质的合成，并能抑制成纤维细胞增殖和创伤愈合。文献报道豚鼠鼓膜穿孔后局部使用浓度为50 mg/ml的5-FU可使穿孔延迟愈合最长达3周，但也有学者使用大鼠动物模型，发现相同浓度的5-FU仅可使穿孔维持14.62天。研究显示单独使用5-FU仅能使鼓膜穿孔愈合延迟，故仅适用于慢性鼓膜穿孔动物模型制作的辅助手段。

1.1.3 糖皮质激素类药物

糖皮质激素类药物最早应用于皮肤科领域，此类药物可通过减少表皮和成纤维细胞复制，延缓巨噬细胞趋化性，减少交联及细胞基质中重要成分透明质酸的合成来发挥其作用。Spandow和Hellstrom于1993年首次报道在SD大鼠鼓膜穿孔处局部使用氢化可的松，12周后鼓膜穿孔率为33.3%。之后此类药物常被单独或联合使用以制作慢性鼓膜穿孔动物模型，其中包括地塞米松、氢化可的松和泼尼松龙等[16]，但研究发现单独使用泼尼松龙不能使鼓膜延迟愈合。

1.1.4 秋水仙碱

秋水仙碱是一种生物碱，能通过阻止微管聚合来抑制有丝分裂，从而使染色体停滞在分裂中期。Haim等[17]报道，大鼠鼓膜穿孔后予以浓度为0.01%的秋水仙碱液滴耳，最长仅能使穿孔维持3周左右，且高浓度（＞0.01%）秋水仙碱溶液具有耳毒性风险。

1.1.5 Mensa（2-巯基乙磺酸钠）

Mensa是一种粘液溶解物质，通常用来预防某些抗肿瘤药物引起的尿路上皮损伤。Karli等[18]报道使用Mensa可延长鼓膜切开术后穿孔鼓膜的愈合时间，但最长仅为7天，故其不适合作为慢性鼓膜穿孔的制作方法。

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1.1.6 戊二醛

戊二醛是一种低毒的有机化学溶剂，常用作杀菌消毒剂和防腐剂，可使蛋白质变性，并可通过抑制鼓膜中间纤维层的血管再生来延缓创伤愈合。曾有学者用浓度为2%的戊二醛制作狗慢性鼓膜穿孔模型，观察15周，其穿孔率为57%[19]，但该动物模型之后未见再次报道，且研究发现使用戊二醛具有潜在耳毒性风险。

1.2 物理方法

1.2.1 鼓膜热烧灼法

该方法为对鼓膜进行热烧灼以制作穿孔，观察期内如穿孔愈合则再次予以热烧灼。既往研究报道显示该方法的穿孔成功率为69%-83%[20,21]，然而热烧灼可改变鼓膜的正常结构，并影响后期修复效果的相关研究[21]。

1.2.2 鼓膜穿孔边缘内翻法

自Amoils等人首次报道以来，该方法一直是最常用的慢性鼓膜穿孔动物造模方法，具体为切开鼓膜后，对鼓膜穿孔边缘的内侧面进行搔刮，并把穿孔边缘上皮内翻以制作光滑的鼓膜穿孔。既往报道的成功率为55-100%[22]，但近期Emami等[23]报道使用该方法制作栗鼠慢性鼓膜穿孔模型，6周后所有栗鼠的穿孔均愈合，且平均愈合时间为4.8周，这可能与动物个体差异、饲养环境、手术器械和实验人员技术水平等因素相关。该方法缺点包括技术操作难度较大，有继发胆脂瘤风险，不能使用大鼠而仅能使用栗鼠，因后者外耳道短宽且鼓膜面积较大，然而有些国家例如如澳大利亚禁止饲养栗鼠，故该方法的使用具有一定的局限性[21]。

1.2.3 鼓膜反复穿孔法

1.2.4 锤骨柄部分切除法

据报道，行鼓膜穿孔后，部分切除锤骨柄并联用丝裂霉素C，10周后87%的鼓膜穿孔仍存在。但该方法切除了部分锤骨柄，而既往研究早已证实锤骨柄在鼓膜创伤愈合过程中起着极其重要的作用，因该部位与鼓环为鼓膜愈合过程中干细胞的增殖区域，故该方法破坏了鼓膜正常结构，影响鼓膜穿孔愈合过程，从而不利于后续的鼓膜修复研究[25]。

1.2.5 鼓膜通气管植入法

临床上，鼓膜通气管植入常用来治疗保守无效的分泌性中耳炎，但通气管长期植入后有导致患者慢性鼓膜穿孔的风险，据报道其发生率可高达10-30%[26]。因此，近期Wang等[27]利用鼓膜通气管植入2周后，局部联用丝裂霉素C（0.5 mg/ml）和地塞米松法成功建立了大鼠慢性鼓膜穿孔模型，10周后慢性鼓膜穿孔的造模成功率达70%。

2 鼓膜穿孔动物模型的局限性

综上所述，单独使用化学药物如丝裂霉素C、地塞米松、氢化可的松、5-氟尿嘧啶、秋水仙碱或Mensa均只能延长穿孔愈合时间，因而不能制作慢性鼓膜穿孔模型。同样，单独使用鼓膜反复穿孔法非但不能使穿孔延迟愈合，反而会促进鼓膜穿孔愈合。目前报道成功且具有应用价值的方法包括丝裂霉素C和地塞米松或氢化可的松的联用法、穿孔边缘内翻法、鼓膜通气管植入并联用丝裂霉素C和地塞米松法这三种。首先，丝裂霉素C和地塞米松或氢化可的松的联用法在丝裂霉素C的浓度、使用时间和重复次数以及地塞米松的使用方法（如局部滴注或明胶海绵浸泡留置）、持续时间和重复次数等方面均存在争议，目前尚无统一的标准，仍需后续进一步的研究证实。其次，鼓膜穿孔边缘内翻法自1992年首次报道以来被广为接受，是目前最为常用的方法，常与鼓膜热烧灼或反复穿孔法联用，虽然成功率较高，但其操作难度大、对动物种类要求高（需选择栗鼠等较大动物），近期也屡被质疑，故其不是理想的造模方法。此外，鼓膜通气管植入并联用丝裂霉素C和地塞米松法由Wang等[27]研究者首次报道，其方法为鼓膜穿孔后留置鼓膜通气管2周，并在制作穿孔及移除通气管时，在穿孔边缘局部使用地塞米松与丝裂霉素C，观察8周后约70%的鼓膜穿孔仍存在。其机制为大鼠急性鼓膜穿孔通常在5-12天内愈合，而通气管留置2周可有效降低急性穿孔愈合率，丝裂霉素C可抑制细胞DNA复制和有丝分裂，地塞米松则可延迟巨噬细胞趋化及细胞增殖。虽然其成功率可达70%，但该方法仍较为繁琐，而理论上理想的慢性鼓膜穿孔模型制作方法应为简单实用且易于推广，故今后仍需继续探索使其更为简便有效。

临床上慢性鼓膜穿孔患者常常伴有咽鼓管功能障碍、耳漏和鼓室黏膜病变，因此制备单一鼓膜穿孔的动物模型往往不足以反映临床患者所有的病理改变。故Peter等[28]使用听泡填塞明胶海绵的方法制作了伴有咽鼓管功能障碍的小鼠慢性鼓膜穿孔模型，为今后制作出与临床患者更为相近的动物模型提供了新思路。此外，近年来研究发现一些以往报道为成功的动物模型其实并不是真正意义上的慢性鼓膜穿孔动物模型，许多仍为亚急性或愈合延迟的动物模型，并且既往研究缺乏耳内窥镜和病理组织学依据来科学评价此类动物模型，故今后需要更多研究来对以往报道成功的造模方法进一步明确[10]。

此外，动物种类的选择也极其重要。目前常用的动物种类包括大鼠、小鼠、豚鼠和栗鼠等，研究者需了解每种动物的优缺点及其对应于人类鼓膜的解剖结构差异。许多学者常选用小鼠来制作鼓膜穿孔模型，但小鼠鼓膜的平均表面积仅为3.9 mm2，与人类鼓膜组织（平均表面积65-85 mm2）相比组织太小，因而不易于手术操作[27]。栗鼠鼓膜的平均表面积为56 mm2，其大小和结构与人类鼓膜相似，且栗鼠耳道短、宽、直，故有利于中耳手术操作[21]，但缺点为购买和饲养成本较高，并且澳大利亚等国家禁止进口和饲养栗鼠，因而在这些国家和地区便不能开展栗鼠的相关实验。大鼠价格便宜且饲养方便，但其鼓膜组织较小（平均表面积仅11 mm2），也不利于手术操作。豚鼠听觉灵敏，其鼓膜大小和结构与人类非常相近，虽然外耳道较弯曲，但因外耳道短，故操作也相对容易，故适用于鼓膜穿孔模型的制作。狗的鼓膜平均表面积为30-55 mm2，但其外耳道异常弯曲而不适合手术操作，故近年来鼓膜相关的实验研究极少选用狗。

总之，理想的慢性鼓膜穿孔动物模型应具备以下特征：①穿孔时间≥8周，且具备病理组织学依据；②造模方法简单易学、微创、可重复性高、死亡率小、成功率高、无毒副作用；③动物种类的选择应是解剖结构最接近人类，且易于手术操作、获得简单、价格便宜、易于饲养、对麻醉药物有较好的耐受性。

3 展望

虽然既往有许多种类的造模方法被报道，但目前仍缺乏一种真正有效、理想的慢性鼓膜穿孔动物模型，从而使得鼓膜穿孔及其修复再生研究领域的发展受到限制。一种理想的慢性鼓膜穿孔动物模型其穿孔时间应维持在8周以上，并具备病理组织学依据，而目前多数文献报道的模型并不能完全满足这些要求，故一些以往较常使用的方法其可靠性现屡被质疑。此外，实验动物选择应当价廉且易于获取，实验方法应当操作简单、可靠性高且易于推广，这都有待今后的进一步研究。