Cx26缺陷遗传性耳聋病理机制的研究进展

袁文慧 李创 余本铨 古韵芳子 朱纲华 肖自安

中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科中南大学耳科研究所（长沙410011）

GJB2基因编码的缝隙连接蛋白26（Connexin26，Cx26）是耳蜗中最重要的一种缝隙连接蛋白（Cx），在耳蜗缝隙连接（Gap Junction，GJ）中高度表达[1]。Cx26是最常见的也是危害最大的耳聋基因[2]，目前发现Cx26突变不仅可造成先天性耳聋，还可引起迟发性耳聋。关于Cx26突变的致聋机制尚不明确，现就近年来由Cx26突变导致的先天性耳聋和迟发性耳聋的研究进展予以综述。

1 Cx26突变导致耳蜗内淋巴液K+循环障碍的假说被质疑

Cx26是β-2型缝隙连接蛋白家族的一员，是构成耳蜗GJ的主要蛋白单位。Cx26、Cx29、Cx30、Cx31、Cx32、Cx43和Cx45等缝隙连接蛋白在耳蜗中组成两套独立的GJ网络系统：（1）内耳非感觉上皮细胞系统，如支持细胞、齿间细胞、内沟细胞及邻接螺旋韧带的外沟细胞等（2）内耳结缔组织细胞系统，如耳蜗血管纹、基底膜、螺旋缘及前庭间质细胞等。Cx26是在耳蜗中表达最强的连接蛋白，在耳蜗两个GJ系统中都高度表达。Santos-Sacchi和Dallos在1983年提出了内耳GJ功能假说[3]：耳蜗GJ是外毛细胞(OHC)复极相K+循环回流到内淋巴的特异性通道，维持着耳蜗内淋巴液高K+形成的正电位[4]。简单来说，K+通过耳蜗GJ系统中的离子通道，先由外淋巴腔流入内淋巴腔参与形成毛细胞感受器电位，维持稳定内淋巴电位，然后再返回外淋巴腔，形成了耳蜗内环境中的K+循环。耳蜗K+循环被认为是维持内淋巴高K+浓度和耳蜗电位的关键。早期的研究已经证实，Cx26的表达与耳蜗的发育保持平行，它对维持和促进耳蜗的发育、成熟和功能具有重要意义[5]，同时Cx26在耳蜗GJ通道中对于分子的渗透性表现出很强的电荷选择性，Cx26突变可能在耳蜗细胞间信号传导及营养和能量供应中产生特异性、不可弥补的损害，从而导致细胞变性和听力丧失，提示Cx26在耳蜗细胞间信号传递及营养和能量供给中具有重要意义[6]。根据GJ在耳蜗中的功能的假说，学者们推测Cx26突变导致耳聋的病理机制可能是因为Cx26缝隙连接功能缺陷导致耳蜗内淋巴液K+循环障碍，认为GJB2基因突变后产生有功能缺陷或无功能的Cx26蛋白，影响耳蜗GJ的通透性损害GJ的耦合，破坏K+循环，导致毛细胞周围间隙K+积累，产生毒性，最终损害毛细胞，从而发生耳聋[7]。

文献报道，体外细胞实验发现Cx26突变体的病理改变有：(1)突变体（如 p.R184P、p.W24X、p.235delC）不能到达细胞膜形成功能缝隙连接斑；（2）突变体（如p.M34T、p.R75W）对野生型Cx26及共同表达的Cx30有显性或负显性效应；(3)突变体（如p.M34T）能被合成并定位到细胞膜，但不能形成有效的缝隙连接；（4）突变体（如p.V84L）缝隙连接能通过离子，但不能通过小分子如IP3，并影响Corti器发育；（5）突变体（如p.V84L和p.V95M）能形成功能性同型缝隙连接，但不能组合异型缝隙连接；（6）突变体（如p.G45E）出现异常的半通道活动，在正常水平Ca2+中导致细胞溶解和死亡；（7）突变体（如p.R75W）影响缝隙连接斑的形成，减小缝隙连接斑面积和蛋白水平；(8)突变体（如p.D50N和p.G11E），细胞内Ca2+浓度异常导致细胞坏死；（9）突变体（如D50A和A88V）出现半通道活性增强，通过影响细胞外Ca+浓度从而改变半通道电流，最终导致细胞功能障碍和细胞凋亡[10-16]。这些研究提示，GJB2突变可在Cx26蛋白质翻译、运输或半通道装配等不同环节影响Cx26缝隙连接细胞间通信功能[8,9]。有学者还在Cx26突变患者的颞骨病理切片发现OHC变性，血管纹发育不全，螺旋神经节细胞正常[17]。怀疑OHC变性可能是OHC内高K+浓度中毒所致。但是，迄今未发现Cx26缺陷耳蜗内淋巴液K+循环受损假说的直接证据。

而且，耳蜗K+循环障碍理论不能解释Cx26缺陷的一些临床现象和实验结果：(1)Cx26和Cx30均在耳蜗相同细胞丰富表达，都能很好地通过K+循环，但Cx26缺失后其功能不能被Cx30补偿，而Cx30缺失却能被Cx26过表达补偿，说明Cx26在耳蜗感觉上皮发育过程中起着不可替代的作用，是正常听力必须的功能物质[18]。(2)Cheng等在部分GJB2突变耳聋患者中，用耳声发射记录到OHC功能，除少数GJB2突变外，突变型和听觉表型之间无明显相关性，突变功能改变与表型之间也没有明确的关系[19]。(3)在有些突变动物模型中没有出现毛细胞凋亡，如R75W突变小鼠，Corti器发育形态出现畸形，但OHC发育正常[20]。(4)有些突变体如p.V84L和p.V95M有离子通透能力，但仍导致耳聋[21,22]。

2 Cx26条件敲除小鼠模型的建立与应用

动物模型是基础生物学和人类疾病机理研究的基本工具，同时也是疾病防治研究和治疗手段开发的必经之路基石所在[23]。因此，成功建立一个Cx26缺陷动物模型对于研究其发病机理具有非常重要的意义。由于Cx26对于胎盘上的缝隙连接具有非常重要的功能，当Cx26缺失时，可影响胚胎组织细胞60%以上的葡萄糖转运而具有胚胎致死性，Cx26基因敲除小鼠不能建立[24]。2002年，Cohen-Salmon等利用Cre-loxP系统，采用Otog启动子将Cx26的敲除范围局限在内耳上皮细胞系统，当Otog启动子在耳蜗内表达时，Cre酶能特异性地识别在Cx26基因中插入的loxP序列，并达到基因敲除的目的[25]。随后，由于对Cx26致聋的发病机制及病理生理过程的深入研究，不同的学者建立了不同类型的Cx26条件敲除小鼠模型。Lin X团队在2009年也利用Cre-loxP系统通过3个不同的启动子（即Pax2、Foxg1、Rosa26）建立了3种不同的Cx26基因敲除小鼠模型[26]。其中Pax2、Foxg1以及Otog基因属于定点敲除Cx26小鼠模型，即利用基因重组技术将Cre序列插入到不同启动子的基因位点，建立一个Cre基因与小鼠基因的同源重组序列，从而达到基因敲除的目的。而Rosa26基因属于定时敲除Cx26小鼠模型，通过体内注射人工合成的雌激素拮抗剂他莫昔芬（TMX），激活Cre重组酶，达到Cx26基因敲除的目的。2013年，Zhao HB团队提出利用Prox1特异性敲除小鼠耳蜗Deiters细胞和柱细胞中Cx26的模型，使得Cx26基因敲除小鼠模型进入一个耳蜗亚分区的时代[27]。由于不同的启动子表达的部位不同及表达时间上的不同，Cx26敲除小鼠模型的表达模式也具有一定的差异性。Cx26条件敲除小鼠模型的建立推动了Cx26致聋机制的研究。

3 Cx26突变先天性耳聋可能是耳蜗发育障碍所致

正常小鼠耳蜗在出生后第5天（P5）耳蜗隧道开始张开，P10时耳蜗电位和内淋巴液K+浓度达较高水平，P14出现听力，P19-P20耳蜗发育成熟。出生后5天GJB2基因敲除的小鼠，耳蜗Cx26缺失，出现耳蜗发育障碍和先天性耳聋，表明Cx26在小鼠耳蜗出生后早期（5天内）的表达对耳蜗的发育和成熟起关键作用[10]。小鼠耳蜗大上皮脊是一个发育结构，在Corti器成熟过程中起重要作用，出生时存在，一般P10消失，出生后大上皮脊细胞凋亡是耳蜗正常发育所必须。在R57W突变敲入小鼠，在P12仍可见大上皮脊细胞凋亡和形态保留，说明Cx26功能缺失可能延迟大上皮脊细胞凋亡，促进大上皮脊细胞生存，导致了Corti器的塌陷，提示Cx26在耳蜗发育过程中可能在调控细胞增殖和凋亡中起着关键作用[9]。

Zhao HB及Lin X等团队研究认为，Cx26缺陷先天性耳聋的最初机制是耳蜗发育障碍[10,11,26,28]。正常小鼠出生后，耳蜗中Cx26的表达随时间直线上升直到小鼠听力成熟。Lin X等在Cx26敲除小鼠耳蜗中发现Corti隧道在出生后的耳蜗发育期均不能打开，认为Cx26敲除小鼠中耳蜗Corti器损伤先于听力损伤，Corti器隧道不能张开是一件标志性事件[28]。Liang等研究报道，Cx26敲除小鼠听力损伤先于毛细胞丢失和耳蜗细胞退变，出生后P14天各频率ABR听阈在100dB SPL以上，表现为先天性聋，此时观察到的Corti器并无明显的细胞退变和细胞丢失，但Corti器隧道塌陷。Cx26敲除小鼠成龄后，Corti器出现明显的毛细胞、支持细胞和螺旋神经元退化变性，P69天时耳蜗第二回基本上已无毛细胞和支持细胞，但严重的毛细胞缺失和螺旋神经元退变仅发生在底回和中回，膜片钳记录显示基因敲除小鼠OHC功能仍正常[29]。Minekawa等人发现，Cx26 R75W突变基因敲入小鼠，Corti器的高度变小，中轴横切面增宽，Corti隧道、Nuel间隙、环绕OHC周围间隙缺如，内柱细胞内微管数量明显减少，Corti器塌陷导致形态学改变，支持细胞增宽引起耳声发射受影响失真，OHC发育正常并保有功能，但畸变产物耳声发射（DPOAE）减弱[20]。Jagger等报道，R75W突变小鼠2周时，Corti器隧道存在发育畸形[30]。Wang等报告Cx26裸鼠耳蜗在出生时总体形态和细胞分化无异常，出生后Corti器发育停滞，Corti隧道和Nuel间隙不张开，P8天时Claudius细胞退变，P13天时观察到耳蜗中回OHC开始丢失，但内毛细胞(IHC)完好，从中回开始的大量细胞凋亡逐渐转向底回，并导致相应部位的螺旋神经元继发退化[26]。Chen S等通过建立一个P0和P8天敲除Cx26小鼠动物模型发现Cx26参与了出生后Corti器中柱细胞的骨架构成，畸形的骨架构成可能会对Corti器的支撑框架产生负面影响。在PO基因敲除小鼠中，柱细胞中微管的减少可能是导致Corti隧道无法打开的原因[31]。这些结果表明，Cx26在小鼠耳蜗出生后对Corti器成熟及听觉出现前维持Corti器内环境平衡及稳定起着重要作用,Cx26缺失导致的先天性聋的最初原因不是耳蜗细胞退变，而可能是由于耳蜗发育障碍。

4 Cx26突变迟发性耳聋可能是因为耳蜗主动放大作用障碍

耳蜗依赖于耳蜗主动放大作用以增强听觉敏感性和频率特异性，OHC电致运动是耳蜗主动放大作用的主要来源，OHC电致运动是由质膜上马达蛋白prestin引起的[32]。Zhao HB及Lin X团队等研究发现，Cx26缺陷迟发性聋是由于耳蜗主动放大作用受损[11,29,33-35]。Zhu等采用时间控制诱导基因敲除技术，观察了出生后不同时间点在小鼠耳蜗敲除Cx26对听觉功能的影响，P5天后敲除Cx26出现类似于临床的迟发性耳聋，小鼠出现高频开始的、轻-中度进行性听力下降，耳蜗发育正常，无明显毛细胞丢失，但DPOAE降低，OHC电致运动相关非线性电容右移，电压斜度降低，耳蜗电位降低但与进行性听力减退不关联，提示Cx26缺失损害耳蜗主动放大功能导致迟发性聋[33]。Wingard等报道，支持细胞缺失Cx26影响OHC电致运动，Cx26缺失小鼠保持有正常的OHC发育，但电致运动发生改变，DPOAE检测发现耳蜗主动放大作用减低[11]。在小鼠耳蜗Deiters细胞和柱细胞Cx26靶向缺失时，导致OHC超极化，耳蜗主动放大作用降低，DPOAE明显减小，高频听力降低，较短的OHC受影响更明显，结果提示耳蜗主动放大依赖于支持细胞GJ，Cx26缺失降低耳蜗主动放大作用导致听力减退[27]。研究发现，在P5天以后的条件性Cx26基因敲除小鼠耳蜗发育正常，在幼龄有听力，保持听觉到青年期，耳蜗隧道正常张开[10,33]。这些研究发现提示，P5天以后Cx26缺陷影响OHC质膜prestin功能，从而耳蜗主动放大作用受损。最近的研究发现，Cx26靶向缺失的小鼠的听力损失和主动放大作用的减少是呈渐进性的，并且在高频和低频区域是不同的，首先发生在高频区域，然后逐渐延伸到中低频区域。这些数据表明，GJ对耳蜗主动放大作用的影响是渐进性的，在成人的高频和低频区域均存在。这与Zhao HB团队之前的发现也一致[36]。

5 总结与展望

人类遗传学的研究已经证明，GJ网络对于人类听觉功能的形成不可或缺[37]。而Cx26基因是最常见和危害最大的耳聋基因，了解其致聋的机制无疑是一项伟大的工程，无论是对个人及家庭，还是对整个社会，都具有非常重大的意义。Cx26缺陷可导致先天性耳聋和迟发性耳聋，两种表型的耳聋机制可能不同，不能用耳蜗内淋巴液K+循环障碍假说进行解释。Cx26突变导致的先天性耳聋不是由于细胞的退变和耳蜗电位的降低，而可能是由于耳蜗本身的发育障碍，发育障碍会导致顶盖膜无法移动，无法刺激毛细胞在声刺激过程中产生听觉受体电流。在这个过程中，Corti器隧道能否张开是一件标志性的事件。而Cx26突变引起的迟发性耳聋，则可能是由于OHC电运动减少引起的电生理改变，导致耳蜗主动放大作用受损，从而引起耳聋。而最新的研究显示Cx26缺失小鼠的耳聋与主动放大作用的降低是渐进性的，并且不同频率之间是不同的。随着对Cx26突变致聋机制的进一步认识，在将来有望通过基因编辑、基因功能替代等方法阻止Cx26突变导致耳聋的发生。