儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药相关基因研究进展

陶建萍 蔡永林

近年来，我国肺炎链球菌感染发病率逐渐升高，同时，欧美等其他国家也出现了较为明显的肺炎链球菌感染性疾病发病率增长的现象。β内酰胺类抗生素是临床治疗肺炎链球菌感染的常用药，而肺炎链球菌耐β内酰胺类抗菌药物现象的出现则严重影响了这类药物的应用及治疗效果。因此，本研究将与儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药相关基因有关的研究综述如下。

1 肺炎链球菌

作为社区获得性肺炎、中耳炎等感染疾病的主要致病菌，肺炎链球菌以儿童、老年人为易感人 群[1]。这种致病菌以蛋白质、肽聚糖及多糖等为主要成分[2]。除了社区获得性肺炎等常见感染性疾病外，这种致病菌还可能诱发脑膜炎、脓胸等严重侵袭性肺炎链球菌病[3]。上述疾病的发生均会影响患者的日常生活，甚至可能威胁人们的生命安全。

2 肺炎链球菌耐药

近年来，随着抗生素滥用现象的加剧，肺炎链球菌耐药变得越来越普遍。RR Reinert[4]认为，肺炎链球菌对青霉素等β内酰胺类抗菌药物产生耐药的作用机制主要与青霉素结合蛋白有关。机体细菌青霉素结合蛋白因相关因素影响发生突变，造成青霉素结合蛋白结构产生变化，同时，上述变化导致这种蛋白对抗生素的亲和力水平发生显著降低，进而诱发β内酰胺类抗菌药物耐药，影响β内酰胺类抗菌药物的治疗效果。

儿童是肺炎链球菌的高危感染人群。研究提示，儿童肺炎链球菌对亚胺培南、青霉素等的耐药率处于上升状态，提示肺炎链球菌耐药菌株不断增加，耐药性不断增强。2017年CHINET 中国细菌耐药性监测研究显示[5]，4511 株非脑膜炎分离肺炎链球菌根据青霉素药敏试验结果，其中3212 株儿童株中PSSP、PISP和PRSP的检出率分别为86.8%、11.0%、2.2%。若未及时干预，β内酰胺类抗菌药物治疗儿童肺炎链球菌疾病的效果将受到极大影响，进而影响患儿的治疗安全性。

3 儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药相关基因

3.1 菌株筛选菌株筛选无疑是分析儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药相关基因的关键。临床肺炎链球菌疾病治疗中常用的β内酰胺类抗菌药物较多，如头孢呋辛钠、莫西沙星、头孢吡肟及青霉素钠等。为了保障菌株筛选质量，整个筛选过程除了需要严格参照《全国临检操作规程》实施操作外，还应尽量选用E-test 法实施检测[6]。

3.2 细菌总DNA 提取确定儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药基因是抑制肺炎链球菌对β内酰胺类抗菌药物耐药的关键环节。分析耐药相关基因时，筛选出菌株后，可采用煮沸法、水浴离心处理法获取肺炎链球菌耐药基因的基因组DNA 模板[7]。

3.3 制备引物与基因检测制备引物时，为了确保耐药相关基因分析效率，可将GenBank 登录肺炎链球菌R6 株全基因序列作为参照依据。而行基因检测时，应分别以随机抽样法选择数量接近的β内酰胺类抗菌药物耐药菌株等。Huang Yong等[8]认为，应将PBP2b 基因、PBP1a 二等青霉素结合蛋白基因、青霉素耐药相关基因、肺炎链球菌非青霉素结合蛋白基因纳入耐药相关基因分析的范畴，而基因检测方法则应选用PCR 法。

3.4 PCR 扩增及基因测序PCR 扩增缓解中，为了确保最终耐药相关基因分析结果的准确性，应分别设置阴性对照组（选用肺炎链球菌ATCC 49619DNA模板）、空白对照（无DNA 模板），由此判断PCR 反应的特异性。朱奇峰[9]指出：耐药相关基因分析中，假阳性结果、假阴性结果的产生可影响最终分析结果的准确性，因此，PCR 扩增试验应分别针对每个样本的PCR 反应重复1次，以确保最终耐药相关基因分析结果可作为肺炎链球菌对β内酰胺类抗菌药物耐药抑制工作的参照依据。基因测序时，需将标准β内酰胺类抗菌药物敏感菌株作为测序结果的参照依据[10]，最终根据所分析基因的变异率信息及氨基酸置换模式，判断其是否与肺炎链球菌耐β内酰胺类抗菌药物有关[11]。

3.5 相关基因分析结果

3.5.1 PBP 基因 事实上，面对当前临床日益增长的肺炎链球菌耐β内酰胺类抗生素问题，探讨肺炎链球菌耐药机制及耐药相关基因势在必行。柏晓辉[12]将由青霉素结合蛋白改变诱发的肺炎链球菌耐β内酰胺类抗生素作为重点，分析这种致病菌的耐药相关基因，结果表明：青霉素结合蛋白基因变异发生于SSN 序列及其周围区域、STMK 序列，青霉素结合蛋白基因（PBPs）变异是造成肺炎链球菌感染患儿β内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因。韩娇等[13]通过对肺炎链球菌感染患儿耐药相关基因的分析指出：肺炎链球菌对β内酰胺类抗生素耐药与PBP2x、PBP1a、PBP2b 变异有关，且当基因保守序列及周围变异位点数量增加时，β内酰胺类抗生素最小抑菌浓度参数也将随之产生变化，二者呈正相关。

张春玲等[14]研究中详细探讨了肺炎链球菌耐药基因—PBP2b的氨基酸置换模式，在PBP 耐药基因中，PBP2b 基因最先发生变异，氨基酸置换主要发生于T431/Q432-F437 序列中（置换氨基酸数量为6～7个）。Matsumoto Ayumi等[15]的研究也验证了上述观点，并指出：PBP2b 耐药基因中保守序列448SSN 可能是导致肺炎链球菌感染患儿对青霉素耐药的主要原因。该保守序列中，氢键为青霉素R1 侧链碳基与序列中450Asn的连接媒介，而在该保守序列后，氢键的媒介作用可受到Thr451-Ala 突变机制的干扰，同时，这一机制还会造成PBP2b 基因对青霉素这种β内酰胺类抗生素的亲和力下降，进而影响其治疗肺炎链球菌干扰患儿的效果。俞春松等[16]的研究也阐述了类似观点。

季伟等[17]指出：PBP2x 氨基酸置换为造成肺炎链球菌耐药的主要原因，二者之间的关联可通过定向诱导试验、PBP2x与肺炎链球菌的关系（前者为后者的必需蛋白质之一）等进行证实。樊欢等[18]也将PBP2x 作为肺炎链球菌耐药相关基因分析的重点，其在研究中指出：这种基因对肺炎链球菌耐药性的影响与Thr338-Ala 变异有关，原因为这种变异机制可波及β4 区域及α2 区域的氢键结合力，导致水分子结构形成受到感染，进而造成对β内酰胺类抗菌药物的酰化作用下降。

研究指出：PBP1a 在β内酰胺类抗菌药物（头孢噻肟、青霉素等）的高度耐药中扮演着重要角色[19]。石燕华等[20]以头孢噻肟的青霉素结合蛋白转化敏感菌株、肺炎链球菌高度耐药菌株开展实验分析，结果均证实PBP1a 基因与β内酰胺类抗菌药物耐药存在关联。张春玲等[21]的研究也与上述结果一致。

3.5.2 非PBP 基因 Müller Miriam等[22]在研究中重点探讨了非PBP 基因变异与肺炎链球菌耐药的关联：murM 基因变异可造成肺炎链球菌对头孢曲松、青霉素等β内酰胺类抗菌药物耐药，但其仅限于接受高水平β内酰胺类抗生素治疗对象（头孢曲松、青霉素的高水平范围分别为抗生素最小抑菌浓度超出2µg/L、8µg/L）。丁晶晶等[23]的研究认可了murM 基因变异与肺炎链球菌耐药的关联，但同时指出：这种基因无法单独诱发肺炎链球菌耐药，而需与其他基因形成联合机制，方可影响β内酰胺类抗菌药物治疗肺炎链球菌感染性疾病的效果。

Ma X等[24]在研究中分析了CiaH 这种非PBP基因对肺炎链球菌耐药的影响：这种基因的胞内C端、胞外N 端分别具有良好的激酶活性及感应器功能，同时也含有组胺激酶-受体CiaRH 系统。组胺激酶-受体CiaRH 系统可对有不同阶段细胞壁抑制剂诱发的细胞溶解机制产生较强的抵抗作用，因此，可认为CiaH 基因与肺炎链球菌对万古霉素等β内酰胺类抗生素耐药有关。

樊欢[25]认为：cpoA 基因可造成儿童肺炎链球菌对哌拉西林耐药。这种非PBP 基因与CiaH 基因对肺炎链球菌耐药机制影响的区别在于：后者对肺炎链球菌感受态的诱导活性消失，而cpoA 这种糖基转移酶耐药基因则仍保留一定的肺炎链球菌感受态诱导活性，但这一特征的出现阶段较晚，因此可认为这种基因参与肺炎链球菌耐β内酰胺类的耐药机制。

3.6 儿童耐β内酰胺类肺炎链球菌耐药相关基因的研究价值β内酰胺类抗菌药物作为临床治疗肺炎链球菌感染的首选药物，其兼具经济成本低、疗效显著等多种优势[26]。但由于抗生素的普及、滥用引发的肺炎链球菌耐药影响了这类抗菌药物优势的发挥。而通过分离菌株、青霉素耐药相关基因TEM 检测等流程分析肺炎链球菌的耐药相关基因，则可为这种致病菌耐药机制提供良好的理论依据。此外，临床检验结果证实[27]，部分耐β内酰胺类抗生素肺炎链球菌感染患儿为多重耐药，因此，耐药相关基因分析不仅可为肺炎链球菌感染治疗用药提供支持，还有利于保障多重耐药感染患儿的治疗效果，并为多重耐药菌株的流行防范提供指导。

综上所述，肺炎链球菌耐β内酰胺类抗生素耐药相关基因包含PBP 基因、非PBP 基因等。单一PBP 位点变异难以造成肺炎链球菌对β内酰胺类耐药。因此，后续肺炎链球菌耐药相关基因分析应进一步加强对不同PBP 位点变异内部及其与非PBP 基因之间的关联，进而判定肺炎链球菌的耐药机制。本研究认为，由于不同地区的医疗环境差异较大，且医疗机构使用β内酰胺类抗生素的习惯各异，因此，其所产生的肺炎链球菌感染治疗效果也存在一定差异。为了减轻肺炎链球菌感染患儿的痛苦体验，应根据当地肺炎链球菌患儿的疾病类型、病情严重程度等，针对性地开展患儿青霉素结合蛋白基因突变及非PBP 基因突变状况的检测，最终根据检测结果确立用药方案，以降低肺炎链球菌患儿的耐药率，遏制多重耐药菌株的流行及发展。