牙源性干细胞干性维持分子机制研究进展

孙丽英，吴家媛

(1.遵义医科大学 贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563099； 2.遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563099)

牙源性干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，因具有易获取、较强的自我更新能力及突出的多向分化能力而在口腔组织工程和再生医学研究中呈现出较强的应用潜质。口腔颌面组织再生工程的干细胞研究目前主要集中在牙髓干细胞(Postnatal dental pulp stem cells,DPSCs)，脱落乳牙干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)，根尖牙乳头干细胞(Stem cells from the apical cells,SCAP)，牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙囊干细胞(Dental follicle precursor cells,DFPCs) 这五种牙源性干细胞的研究上[1]。然而大量研究表明随着体外培养时间的延长，牙源性间充质干细胞的干性(Stemness)，即自我更新能力和多向分化潜能会逐渐降低至彻底丧失[2]，从而影响其在临床实际应用的有效性。干细胞的干性包括两个方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性。干细胞维持自我更新和多向分化潜能的机制较为复杂:转录因子、细胞信号通路、微环境和自噬等对其均有影响。近年来，学者们力图通过研究发现影响牙源性间充质干细胞衰老、自我更新和多向分化能力的潜在机制，为口腔颌面组织再生和临床疾病治疗提供合适的种子细胞，从而获得新的治疗思路。本文根据近年来对牙源性干细胞干性维持的分子机制研究做一综述。

1 干性相关基因和转录因子

干性基因是一类多能干性基因，可调节细胞生长、增殖、分化和凋亡，对干细胞干性维持有积极作用，常见的干性基因有Sox2、Oct-3/4、Nanog、Rex1(Reduced expression 1)及Klf(Krüppel-like factors)[3-4]。他们在胚胎干细胞和部分成体干细胞中高表达，随着干细胞的分化而表达下降，在决定干细胞多能性、状态和发育中起重要作用[5]。未成熟DPSCs也表达Oct-4和Nanog，其转录因子的表达和细胞的分化可持续到第25代[6]。 Wu等[7]也证实随着体外传代次数的增加，人SCAP中Stro-1、Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的基因表达不断下降。

转录因子在多能性维持中具有重要意义，除了内在因素的影响，外在因素促使转录因子表达变化，也可影响干细胞干性。当增加人牙髓干细胞(Human postnatal dental pulp stem cells,hDPSCs)中的Stro-1、Nanog、Oct4和Sox2的表达时，可减少hDPSCs在体外成骨成牙本质分化，维持hDPSCs为未分化状态[3]。Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLF)是一种进化上保守的转录因子，在维持mESCs的自我更新中起关键作用。有研究发现敲除Klf2、Klf4和Klf5后恢复其中任何一个KLF转录因子都会恢复该细胞的自我更新能力[4]。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在体外培养时过表达Klf2，可显著影响其生物学活性，提高其增殖及分化潜力[8]。Klf4表达与牙本质矿化也密切相关，当通过核因子IC(nuclear factor I-C,NFIC)上调Klf4后，牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,Dmp1)的表达会增加，从而促进牙本质矿化[9]。

骨形成蛋白(phogenetic protein,BMP)是调节细胞的分化、增殖和凋亡的重要介质[10]。研究发现BMP7参与体外培养DPSCs后，细胞的增殖能力可随时间的增加而增加，尤其在诱导7d后DPSCs的增殖能力明显提高，研究者进一步证实高浓度BMP7(100ng/ml)可以更好的增加体外DPSCs细胞增殖及细胞的分化[11]。 同样，使用BMP4诱导PDLCs时Sox2、Oct-4和c-Myc的表达一直到PDLCs的第七代仍持续表达，并且Sox2和Oct-4的mRNA表达在第五代和第七代明显上调，说明BMP4促进细胞生长和增殖，在细胞周期的S期中阻滞PDLCs的分化，维持PDLCs未分化状态[12]。

Rho/Rho相关的含有卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated kinase,ROCK)是细胞骨架动力学的关键调控因子之一，可决定干细胞的自我更新和维持干细胞特性。Rho激酶抑制剂可以提高各种来源干细胞的存活率及抑制细胞凋亡，反式-4-[(1R)-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)环已烷甲酰胺二盐酸盐(Y-267632)是ROCK的抑制剂，可调节细胞生长、粘附、迁移，代谢和细胞凋亡，已研究证实 Y-27632可以通过细胞外信号激酶级联反应诱导PDLSCs增殖，上调c-Myc、Nanog、 Klf4和Oct4的基因表达水平，促进PDLSCs增殖及迁移能力[13]。

正如Y-267632上调了c-Myc、Nanog、Klf4和Oct4等干细胞因子，促进PDLSCs分化能力一样，干细胞基因的作用并不是孤立的，通过结合多能性相关转录因子的结合位点，或是直接激活启动子的表达，干细胞基因之间会彼此影响和促进，从而影响干细胞的生物学功能。如Klf4和Klf5通过结合Oct4、Sox2和Nanog的启动子区域而形成内部的调节网络，进而反式调节Klf4和Klf5的表达来维持mESCs多能性的潜力[14]。同样，在HBMSCs中使用慢病毒系统过表达Klf2促进其分化潜能时，多能性相关基因如Oct4、Nanog和Rex1的表达也同时上调。Nanog可激活Rex1启动子并调控Rex1的表达，最终导致氧化磷酸化向糖酵解代谢的转化，从而有利于维持人类多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)的多向分化能力[15]。同源框(Homeobox,HOX)基因在牙齿发育、间充质分化和增殖中起重要作用，当SCAP中 HOXA5缺失时，p16 INK4A、p18 INK4C和Cyclin A的表达会受到影响，从而抑制SCAP的周期进展、成骨分化以及细胞增殖[16]。

2 信号通路在干性维持中的作用

信号通路在牙源性干细胞干性维持中的作用不可或缺。多条信号通路在维持干细胞分化潜能方面发挥巨大作用。如MEK / ERK信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信号通路、NF-kB信号通路和环磷酸腺苷(c AMP,cyclic adenosine monophosphate) 信号通路等。

MEK / ERK信号通路通过细胞周期蛋白B1和TIMP-1蛋白的表达，引起细胞周期进程和细胞的有丝分裂，促进bFGF提高HDPCs增殖能力[17]。Pluripotin、雷帕霉素等小分子可以通过如Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白(RasGAP)、ERK1/2和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR) 等多种信号通路可上调Nanog、Oct4和SOX2的表达、减少细胞分化、在DPSCs培养中可较长时间维持其未分化状态[u2][A3]，对干性维持有积极作用[18]。Plaisant等[19]发现抑制Hh 信号后人MSC的增殖和克隆形成能力都有所降低。激活NF-kB信号通路提高IL6、IL8的表达，可以抑制干细胞的增殖能力，维持其干性[20]。PI3K信号通路在干细胞增殖、分化及干性维持中起重要作用。PI3K相关激酶(PIKK)包含与PI3K序列相似性的Ser / Thr蛋白激酶家族，在调节细胞增殖、代谢、迁移、存活和DNA损伤在内的各种应激的反应中起关键作用[21]。作为第二信使的PI3K，激活AKT和磷脂酰肌醇依赖性激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，对于调控细胞的大小、生长、增殖、存活和糖代谢均有重要作用。当AKT激活后， 磷酸化结节性硬化复合物2(TSC2)，从而解除TSCl/2对 Rheb的抑制，由Rheb活化雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)激活下游靶蛋白，将对细胞生长和代谢进行调控[22]。已研究证明PI3K除了对细胞的增殖作用外，还能促进细胞的自我更新能力以维持胚胎干细胞的未分化状态。

cAMP信号通路是研究得较多的与牙源性干细胞干性相关的信号通路。研究表明抑制SCAP 中cAMP信号通路，会上调矿化基因(ALP、OCN、OSX、RUNX2)mRNA的表达，而抑制SCAP中的cAMP信号通路后，则下调矿化基因的表达[23]。cAMP信号通路对BMSCs、SCAP的增值与分化有一定的调节作用[24-25]。NFIC能够协同 cAMP 信号通路促进SCAP的分化[26]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和生长因子4(fibroblast growth factor4,FGF-4)在长期培养BMSCs时， 通过抑制LC3-II的表达、调控细胞增殖、降低细胞衰老，调控 BMSCs的增殖和分化的潜能[27]。bFGF还可在诱导BMSCs的同时迅速激活AKT，随后激活ERK活化。Wu等于体外长时间培养SCAP时发现bFGF可维持SCAP的干性及Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的表达[7]，同时证实此过程中MAPK通路被激活，推测bFGF维持SCAP干性的机制与MAPK通路相关。该研究团队后又证实Wnt经典信号通路也参与了bFGF 对SCAP干性的维持[28]。也有学者证明bFGF诱导SHED时通过激活SHGFs、 FGFR和Akt信号通路导致Rex1的表达增加，维持SHED在传代中的自我更新能力及多向分化的潜能[29]。

3 其他因素

干细胞的干性维持受到很多条件的影响，除了以上因素，细胞生长环境变化如培养条件、激素紊乱、免疫紊乱、代谢改变和组织工程细胞支架材料等也会对干细胞功能及干性造成影响[30-31]。自噬对干细胞干性维持也有一定的影响，自噬对去除功能失调的细胞器和蛋白质聚积体以及维持干细胞稳态(包括自我更新、细胞分化和体细胞重编程)至关重要[26]。雷帕霉素激活小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)自噬后,其干性相关基因(Nanog、Oct4和Sox2)表达升高，有助于促进细胞的自我更新与分化[32]。自噬激活后可延缓细胞衰老，有效促进细胞增殖并增强集落形成能力。微环境发生变化也可能导致相关组织中相关干细胞功能衰退包括自我更新能力降低、错误分化和呈现衰老相关的分泌表型[33]。

4 展望

随着再生医学和组织工程学的发展，关于干细胞的研究越来越受到关注。在体外保持干细胞特性一直是口腔再生医学的挑战，在适度的增殖能力与良好的分化潜能之间寻找理想平衡是牙源性干细胞发挥组织修复作用的关键。通过对牙源性干细胞干性维持机制的深入研究，不仅有利于掌握牙源性干细胞应用的调控手段，还可进一步明确牙源性干细胞干性维持原理，为临床研究提供足够的干细胞，使细胞在传代和扩增的同时不降低其自我更新能力及多向分化潜能成为可能。