人RPE细胞通过隧道纳米管传递钙信号的研究进展

王 舒，蔡善君

(遵义医科大学附属医院 眼科，贵州 遵义 563099)

钙在细胞生理过程中至关重要，且与各种生物学功能有关，包括蛋白质分泌、细胞外吞、收缩、基因转录和细胞生长等。值得注意的是，引起细胞内钙不稳定的任何干扰都会促使细胞功能从正常调节转变为细胞死亡[1-2]。目前，钙信号在诱导细胞凋亡和坏死[3]过程中的核心作用已经明确。一般来说，膜去极化触发胞内钙内流，启动胞泡融合和胞吐过程，以促进同步突触传递[4]。隧道纳米管(tunneling nanotubes，TNT)可以提供一种特异且有效的细胞间通信方式[5-10]。钙信号通过隧道纳米管在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial，RPE)间转移，打破了以往了解的细胞利用缝隙连接和突触来与相邻细胞沟通，为细胞间传递钙离子提供了新的传递方式，进一步指导临床实践。现对人视网膜色素上皮细胞株Arpe-19通过隧道纳米管传递钙离子的相关文献予以综述。

1 隧道纳米管的简述

细胞间通讯在正常和异常组织环境中的作用已经被广泛研究了几十年。通过对内源性运载工具，如外体和微囊泡的研究，加深了细胞间传递机制的认识[11-15]。间隙连接和可溶性扩散信号，如细胞因子，需要有效和足够的信息，且需要在相对较短的距离传递。然而，对于在生物微环境中距离较远的细胞来说，远程交流是必要的。例如，由于癌细胞通过基质成分分散在肿瘤基质中，它们之间的长距离可能会显著减少它们通过趋化因子、细胞因子或外体/微囊泡的通讯。隧道纳米管(TNT)是细胞间一个独特又高效的联络方式，这可以解释细胞如何通过隧道纳米管引发一系列疾病 ，特别是在癌症中。而首次的实验就是对培养的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞进行了隧道纳米管膜突起的描述。现在用显微镜观察，发现培养的Arpe-19细胞常被TNT连接，且TNT不附着于下层。TNT在细胞间呈直线连接，是一种膜状细胞的延伸，宽度从50～1 000 nm不等，长度从几百微米到几百微米[16-17]，且用扫描电镜证实了TNT的特征。荧光显微镜显示Arpe-19细胞之间的TNT中含有F-肌动蛋白，而不含微管，当人为添加砖红霉素B诱导F-肌动蛋白的解聚，会导致TNT的消失。重要的是，这些TNT可以作为像路西法黄(Lucifer Yellow)这样的小分子的扩散通道，而不是右旋糖酐红(Dextran Red)这样的大分子的通道。最近的研究表明，不同细胞所形成的TNT的形态和组成可能不同。例如，连接人类巨噬细胞的两种不同类型的隧道纳米管：分为只有肌动蛋白的薄纳米管和含有肌动蛋白和微管的较厚的纳米管(直径大于0.7 m)，TNT的功能是充当细胞间交换的管道，包括线粒体、钙离子、蛋白质、高尔基小泡、病毒、微RNA(MiRNAs)和外显子[18-19]。因此，TNT作为细胞的“纳米公路”，用于连接不相邻的细胞介导细胞器和其他物质的运输。倒置显微镜和共聚焦显微荧光成像技术的广泛应用已成为实验室识别细胞器及其他物质通过TNT和直接细胞间转移的主要手段。

大量的证据表明，TNT介导的通讯和运输对于生理条件下正常细胞的功能是必不可少的。虽然隧道纳米管形成的分子机制尚不完全清楚，但刺激条件下，如炎症或任何细胞损伤，已被证明能刺激细胞产生TNT。较短的纳米管在未感染的细胞中常见，而长的纳米管在被感染的细胞中常见。据报道，感染病毒的细胞[20]纳米管的产生频率明显增加，发现至少有两种不同的TNT形成途径。这表明病毒感染可以刺激TNT的形成，一种是从给定的细胞中延伸出来，最终与邻近的细胞接触，从而导致TNT的形成，如PC 12细胞和T24细胞[21]所见。在另一种途径中，是从观察到许多类型的免疫细胞中发现的[22-25]，细胞首先接触，然后出现TNT。这两个过程不一定是相互排斥的，甚至可以同时发生在TNT形成过程中。在这两种情况下，都需要粘附分子来促进TNT的形成和(或)稳定。

此外，Austefjord等[26]人在不同类型的细胞之间也检测到TNT的形成，这些连接有效地介导上皮细胞和成纤维细胞之间的病毒转移。这种转移很可能涉及体内的病毒传播，但在自然感染过程中它或许也发生。通过TNT的转移可能与细胞间通信的其它途径(其它类型的细胞突起、外体或间隙)结合，优选的途径可能取决于细胞状况。

2 人视网膜色素上皮细胞经隧道纳米管的通讯

2.1 视网膜色素上皮 视网膜色素上皮(RPE)是视网膜的单层，位于神经视网膜和脉络膜之间。视网膜色素上皮(RPE)通过将视网膜与脉络膜毛细血管床分离而形成血-视网膜屏障[27]。它是一个活跃的屏障，在许多方面支持神经元视网膜。RPE为视网膜提供营养因子，吞噬从感光器脱落的盘膜，回收维甲酸以维持视觉周期，调节视网膜下间隙的组成和体积。这种高度极化的色素上皮在调节视网膜下间隙的体积和化学成分方面起着至关重要的作用。它也促进了神经视网膜和血管绒毛膜间营养物质和离子的双向转运[28]。RPE作为一种血-视网膜屏障，选择性地转运生物分子，释放保护视网膜所必需的各种因素。尽管RPE细胞具有重要的生理功能，但对RPE细胞间的信号转导通路知之甚少。电生理学研究表明，所有的视网膜细胞通过间隙连接[27-28]与相邻细胞进行通讯。连接蛋白43(Cx43)介导的间隙连接细胞间通讯参与调节视网膜修复和再生。一些研究报告说[29]，细胞凋亡信号可通过间隙连接传递，从而对其相邻细胞产生不利影响。这表明RPE细胞在生理条件下具有非常活跃的细胞间通讯。

2.2 视网膜色素上皮细胞间的TNT TNT在不同细胞类型中的直径、长度、结构和功能各不相同，Arpe-19细胞中的TNT，典型直径为50～300 nm，长度可达120 mm。在Arpe-19细胞培养中，Wittig D[30]发现了直接以TNT相互连接两个细胞，偶尔也发现多达三个或四个不同的TNT连接的细胞，Arpe-19细胞互相接触后形成TNT。这些细胞一开始有接触，然后移动，形成细胞-细胞之间的连接，随着细胞的分裂而拉长，随之产生TNT。最近 在线粒体功能失调的细胞中发现，线粒体可以在细胞间的TNT内移动[31-32]。目前已有研究发现干细胞与RPE细胞直接相接触的情况下通过TNT将线粒体转运至RPE细胞。而年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等视网膜退行性疾病与线粒体的功能密切相关[33-36]。所以，研究RPE细胞间的隧道纳米管可以为眼底疾病提供新的治疗方向。

3 人RPE细胞传递钙信号的产生与传播

3.1 机械刺激诱导人视网膜色素上皮细胞间Ca2+波的传播 目前，TNT被证明以类似于细胞间通过间隙连接传输钙波的方式介导细胞间钙信号的传递，且能够在不亲密接触的细胞之间传输。Khamidakh[37-38]为了研究这一过程，通过单个细胞的机械刺激在Arpe-19单层中诱导细胞间Ca2+波。在存在和不存在细胞外Ca2+的情况下，当细胞内储存Ca2+耗尽后使用Ca2+敏感荧光染料fura-2，用单剂量法来检测单层细胞内Ca2+浓度的动态变化。应用间隙连接阻断剂α-甘草次酸后，在汇合的单层Arpe-19细胞内单个细胞的机械刺激引发Ca2+增加，其以波状方式传播到相邻细胞。这种局部刺激经常在TNT连接的细胞中产生强大的Ca2+信号，从而扩大了通信的范围。

Arpe-19细胞表现出两种不同的Ca2+波，其传播机制依赖于细胞位置：在接近机械刺激部位的细胞中，Ca2+波主要通过间隙连接传播，并且需要来自细胞内Ca2+的储存和细胞外培养基，而更远的传播更依赖于嘌呤能受体，并不需要细胞外的Ca2+。所提出的方法可以用来体外评估人视网膜色素上皮细胞测定药物诱导细胞间通讯变化的工具。

3.2 间隙连接在TNT钙信号传播中的作用 一些实验室观察到TNT中存在连接蛋白和间隙连接，但间隙连接在这些过程和这些疾病中的作用仍在积极研究中[39]。这些观察表明了由TNT介导的长距离连接通讯的可能性。事实上，间隙连接，例如：电突触，首次在心肌和神经中发现了在相邻细胞之间的电迁移。间隙连接在TNT连接的细胞间信号分子的传递中有关联，已发现内源性连接蛋白通过免疫荧光技术在TNT内或附近定位[40-41]。在多种病理类型的疾病中，TNT形成和TNT介导的细胞间通讯显著增加，包括病毒感染、癌症、梅毒以及朊蛋白相关疾病[42-47]。在不同环境下(比如星形细胞间或巨噬细胞间)，连接蛋白43(Cx43)存在于TNT样结构中，而间隙连接通道的抑制并不能阻止它们的形成，但会干扰TNT连接细胞之间的正常通讯。这些数据表明，这两个通信系统在协调通信方面是相互补充的[48]。

目前已经有报告描述了远距离细胞间Ca2+信号的细胞间交换是通过TNT介导的[48-49]，表明在这些结构上存在某种形式的膜/胞质连续性，或在这一过程中存在活跃的间隙连接通道。目前对细胞间Ca2+波传播过程所涉及的机制尚不完全明了，但认为间隙连接与TNT密切相关。

3.3 IP3沿TNT扩散的信号传播 机械刺激除了促进ATP的释放外，还能通过IP3受体(IP3R)通道促进IP3的产生，进而促进内质网释放钙离子。在TNT中观察到局部IP3介导的Ca2+信号，提示它们可能促进细胞间Ca2+波的传播[50]。原则上，通过TNT传播Ca2+信号可能是由Ca2+的直接转移、IP 3从被激活的细胞扩散到引起反应细胞内的Ca2+释放或者Ca2+传递促进IP3诱导应答细胞内Ca2+释放的混合机制[7]所致。为了区分这些假设，观察了TNT连接的连接蛋白(Cx43)细胞之间的通讯，以及细胞内Ca2+升高的位置和时间，分别使用机械刺激和IP3的局部光释放作为刺激，一个关键的发现是，反应细胞中的Ca2+升高是在刺激之后，明显延迟后才开始的，开启IP3R通道绝对需要IP3以及Ca2+ [51]。提示被刺激细胞内IP3其扩散速度快于Ca2+的升高，Ca2+波沿TNT的主动传递可能是通过连接的细胞网络进行通讯，连接细胞在IP3浓度升高后才打开钙通道，使得Ca2+波迅速升高。

4 展望

隧道纳米管(TNT)是细胞间远程通信系统的一种形式，可以介导细胞间钙信号的远距离传输，在人RPE细胞中发现了钙离子沿隧道纳米管传播，钙离子产生及传播的方式通过间隙连接或主动产生IP3，进而产生、传递钙离子。这为治疗眼底疾病开辟了新的治疗机会，为利用隧道纳米管作为细胞输送管道打开一扇新的大门。或许可以通过药物调节这些过程来阻止或增加它们的形成，以掌控通过TNT传播的致病和健康成分的传输。