Duchenne型肌营养不良症基因突变检测及家系调查

谢军 刘刚 王思宇 严蕾 杨超 吕蓉 刘小琦

(1 四川省人民医院皮肤病研究所激光中心 四川 成都 610000)

(2 四川省人民医院疾病基因研究四川省重点实验室 四川 成都 610000)

假性肥大型进行性肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy，DMD)是源于横纹肌的一种连锁隐性致死性遗传病，进行性肌萎缩和腓肠肌无力伴小腿腓肠肌假性肥大是其典型的临床特征，在活产男婴中的发病率为1/3500～1/4000[1]。发病早、病情严重，严重影响患儿生活质量，给社会和家庭带来沉重心理和经济压力。本病由抗肌萎缩蛋白（dystrophin，Dys）基因突变引起，Dys由X染色体短臂Xp21基因编码，分布于骨骼肌和心肌细胞膜的质膜面，起细胞支架作用，维持肌纤维完整性和抗牵拉功能。Dys是肌纤维膜细胞骨架的主要成分，与肌纤维膜蛋白紧密联合为抗肌萎缩蛋白联合蛋白，这些蛋白与细胞的层粘蛋白连接，Dys减少引起肌无力可能与这些联结失调有关[2-4]。由于基因变异引起的Dys缺乏是进行性肌营养不良的主要病因。现有1例临床诊断为假肥大型肌营养不良的患者，其舅舅已因本病去世，其母亲、大姨妈、表姐均可能为缺陷基因携带者。对患者完善相关实验室检查并明确诊断后，对其家属作相关基因检测，了解其基因突变类型后查阅有关文献，与目前结果相比对，明确其是否存在目前尚且未知的基因突变类型。现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选择我院收治的1例DMD患儿，以进行性肌无力以及运动功能倒退为主诉，均经详细询问病史与体检，且联合实验室检查结果确诊为DMD。男性患儿，年龄为9岁，父母双亲非近亲结婚。诊断标准：（1）儿童期隐匿性发病，主要包括如下临床表现：近侧肌无力以及肌肉萎缩，有腓肠肌的假性肥大和/或广泛肌萎缩等；（2）经实验室检查，血清磷酸肌酸激酶水平是正常水平的10倍～数百倍；肌电图呈现出典型性肌病表现，周围神经传导速度保持正常水平；（3）除外多发性肌炎和脊肌萎缩症、重症肌无力等其他肌肉疾病。患儿及其家属均对本研究方案知情，且自愿签署知情同意书，且均经我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集患儿EDTA抗凝外周血2.0ml，应用血液DNA提取盒（由天根生化科技有限公司生产），采用离心柱法将基因组DNA进行提取，然后血样置于-20℃的冰箱中进行保存、待测。DNA总量＞50μL，质量浓度在100～150ng/μL范围之内，采用分光光度仪对其进行测定分析，吸光度在1.8～2.0范围之内。

1.2.2 多重链接探针依赖扩增技术（MLPA）的检测方法 试剂盒均购自于荷兰MRC-Holland公司生产的P035型试剂盒。严格按照试剂盒上的说明进行操作，基因组DNA变性之后，与SALSA MLPA探针之间进行杂交反应，杂交时间在16小时以上，然后将其中加入连接缓冲液与连接酶，进行连接反应，经PCR扩增之后，采用ABI-3130型基因分析仪进行毛细管电泳试验，得到的数据运用Gene Marker v1.6软件进行分析处理。

1.2.3 全基因组新一代测序技术（NGS）检测方法 根据德国生产的QIAamp血液提取试剂盒上的说明书将基因组DNA进行提取，取3.0μL DNA经美国Covaris公司生产的Covaris S2超声打碎随机地分解为长度为250-3000bp的片段，且纯化，对经过纯化的DNA采用T4连接酶以及T4碱性磷酸酶、Klenow片段进行末端修复，且于片段3’端加A碱基，然后通过接头连接形成标准化的Solexa测序文库。

1.2.4 Sanger测序 对NGS检测所发现的点位突变按照具体的突变点位，采用Primer primer 5.0型对引物进行设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，采用PCR技术扩增引物，扩增产物使用测序试剂盒Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems）测序，最后经过ABI PRISM 3130型基因分析仪进行检测分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0软件对本研究中的数据进行处理、分析。

2.结果

经检测分析，发现受检者 DMD 基因 4-7 号外显子缺失变异；发现受检者母亲及二姐 DMD 基因 4-7 号外显子杂合缺失变异；未发现受检者姐姐 DM在大片段变异；未发现受检者三姐 DMD 基因存在大片段变异。

3.讨论

Duchenne型肌营养不良的主要临床特征是进行性肢体肌萎缩肌无力，近端为主，伴小腿腓肠肌假性肥大。一般3～5岁出现症状，呈进行性加重，10～12岁丧失行走能力，多于20岁左右死于呼吸衰竭和(或)心力衰竭。研究中的患儿临床进程基本符合DMD的临床特点[5-6]，值得注意的是相当部分患儿有运动发育迟滞，但常被家长忽略，而经仔细追问，高达77.8%的患儿均有独走的延迟。提示临床医生，在发现不明原因独走延迟的男性患儿时应考虑到DMD的可能性[7]。

DMD为X连锁隐性遗传性疾病，致病基因为dystrophin,位于染色体Xp21，该基因是目前人类发现的最大的基因，长度约2400～3000kb，约79个外显子，编码3685个氨基酸，组成dystrophin蛋白(即抗肌萎缩蛋白)，分子量427KD[8]。Dystrophin蛋白位于骨骼肌和心肌细胞膜内面，为细胞骨架蛋白，具有抗机械牵拉作用，能防止肌细胞在收缩过程中的损伤。Dystrophin与细胞膜内面、跨细胞膜区以及细胞膜外区的多种蛋白如sarcoglycan、dystroglycan等蛋白紧密联合，相互关联，在细胞膜内外组成一个整体，维系细胞膜内外的物质交换和联系，保护细胞膜结构完整和稳定[9-10]。Dystrophin基因缺陷导致肌细胞膜上dystrophin蛋白缺乏或减少，使肌细胞膜不稳定而引起肌细胞坏死和功能丧失。如dystrophin蛋白完全缺乏，则产生DMD表现。

本研究结果显示：经检测分析，发现受检者DMD基因4～7号外显子缺失变异；发现受检者母亲及二姐DMD基因 4～7号外显子杂合缺失变异；未发现受检者三姐DMD基因存在大片段变异。上述结果提示：DMD基因是杜氏/贝氏肌营养不良（DMD/BMD）的致病基因，为X连锁隐性遗传方式（XR）；鉴于该类遗传方式特点（男性携带即发病），不对其父样本进行检测。在受检者DMD基因所发现的4～7号外显子的缺失变异很可能是导致受检者发病的致病性变异；受检者其母、其二姐很可能均为致病性变异携带者。杜氏肌营养不良（DMD）为DMD基因变异所致的 X 连锁隐性遗传病，男性只有1条X染色体，获得致病基因即发病，发病率为1/3500活产男婴。女性携带缺陷基因时一般不患病，除非由于不幸的莱昂化，导致正常基因所在的X染色体灭活而发病。不过由于还有部分细胞为缺陷基因所在的染色体灭活，正常基因起作用，症状要比男性患者轻。DMD病历中散发病例较多，它可能是[11-12]：①隐匿传递的致病基因的“暴露”；②母亲卵细胞减数分裂的“差错”；③母亲生殖腺细胞有丝分裂差错，卵巢中有相当一部分卵母细胞携带变异基因，即“生殖腺嵌合”。除减数分裂中发生的差错再发风险较低外（与一般孕妇相同），隐匿传递的再发风险与家族性病例一样，而生殖腺嵌合的再发风险与变异细胞群的比例有关。由于不能确定变异发生在什么阶段，散发病例都要进行产前诊断。有DMD基因变异患儿生育史的母亲再次生育时，需进行遗传咨询和产前诊断。

综上所述，通过对Duchenne型肌营养不良症患者基因突变检测分析，并对其家系进行调查，可为及时确诊DMD提供遗传学依据。