NOD样受体蛋白亚家族在非酒精性脂肪性肝病发生和进展中的作用

孙鲜策

(大连医科大学 公共卫生学院 劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁 大连 116044)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是代谢综合征的主要表现之一[1-2]，是肝脏相关疾病与死亡的主要因素[3]。在中国，NAFLD的患病率为15%～30%[4]，接近于欧洲的患病率20%～30%[5]，与日本和新加坡等亚洲国家相比，我国的患病率也处于较高的水平[6]。随着经济的发展和人们生活水平的提高，NAFLD的发病率不断升高，已经成为国内外的公共健康问题，严重影响着人们的健康及生活质量。NAFLD的发病与高脂血症、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、肥胖、高血压、2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)及心血管疾病密切相关。之前认为非酒精性脂肪肝是代谢综合征的一个表现，而最近研究发现 NAFLD是T2D和代谢综合征的先决条件。

NAFLD的发生发展机制一直是近年来的研究热点。目前，肝脏炎症反应被认为是促进NAFLD疾病进展的重要原因和关键事件。人体自身固有免疫机制是机体的第一道屏障，NOD样受体蛋白亚家族(NOD-like receptor proteins，NLRPs)参与了机体的固有免疫反应，在人体自身炎症免疫应答中起重要作用，各类NLRPs炎症小体与多种代谢性疾病相关，包括NAFLD/NASH[7-11]。本文对NLRPs炎症小体与NAFLD之间关系的研究现状及进展进行综述。

1 非酒精性脂肪性肝病的发生和进展过程

1.1 非酒精性脂肪肝概况

NAFLD是一系列肝脏疾病的统称，其疾病范围谱较广，包括单纯脂肪变性(steatosis)，脂肪浸润加炎症(lobular inflammation)和肝细胞气球样变性(ballooning)，甚至进展至纤维化(fibrosis)，最终导致肝硬化(cirrhosis)，影响着肝脏及多个肝脏外围组织及调控性通路[12]。一般认为，肝脏细胞中大泡型脂肪变性(macrovascular steatosis)比例>5%，并且没有酒精、病毒、药物等其他能够引起脂肪肝的诱因存在，即定义为NAFLD。而显著的肝脏脂肪蓄积是疾病进展的重要危险因素。绝大多数的 NAFLD 患者没有明显临床症状，大约有30%～40%的NAFLD会进一步发展成为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，其中40%～50%的NASH会有肝脏纤维化的发生[13]。

NASH是由肝脏中过多的脂质积聚引起的慢性肝损伤和炎症的病症。有人将NASH看作整个NAFLD疾病进展的中间环节，因为其既有脂肪变性和炎症，亦有肝纤维化和硬化所需要的胶原基质沉积。NASH的组织学诊断标准包括脂肪变性，肝细胞气球样变和小叶炎症[14]。肝细胞气球样变是指肝细胞增大、肿胀、细胞质稀疏，具有网状外观或含有Mallory-Denk体。小叶炎性通常由淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞组成。门静脉炎症在NASH病人中有不同程度地发生，疾病严重程度与活组织检查评分的严重程度和IR的血清学特征相关。

1.2 二次打击学说

NAFLD的发生发展机制较为复杂，目前学界说法不一，占主导地位的是Day于1998年提出的“二次打击”学说。与肝脏脂质堆积相关的IR为“第一次打击”，脂肪堆积可以使NAFLD患者产生肝脏及周围器官的IR，从而形成恶性循环。肝脏IR需要多种炎症通路以及促炎性细胞因子的参与，包括NF-κB相关信号通路[15-16]及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子[17]，这些炎症细胞因子可以介导内源性免疫应答的产生[18-19]。而炎症是NASH的重要标记[20]，“第二次打击”为IR发生之后的氧化应激反应，是在首次打击的基础上，由活性氧诱导的发生在肝脏实质细胞内的炎症反应[21]，从而加速NAFLD向NASH进展，甚至引起纤维化。近年来也有学者提出“四次打击”的学说，即在二次打击的基础上，机体对受损的肝细胞进行修复，发生“第三次打击”，即肝纤维化，进而肝脏微循环障碍，组织细胞缺血坏死，肝小叶重建，最终导致肝硬化，即“第四次打击”[22]。

由此可知，炎症应答是NAFLD疾病进展的关键节点，起到承前启后的作用。而炎症应答的产生及其发挥作用的分子机制，目前仍不明确。

2 NOD样受体蛋白亚家族与细胞焦亡

2.1 NOD样受体蛋白亚家族的分类

危险相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)可以激活大量的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)导致炎症的发生[23]，NOD样受体蛋白(nucleotide oligomerization domain-like receptor proteins，NLRPs)作为一种新型的PRRs，可以识别DAMPs和PAMPs[20]，其与适配器蛋白——凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)以及半胱天冬氨酸蛋白酶原(procaspase-1)结合形成的蛋白复合体，称为炎症小体(inflammasome)，剪切活化pro-caspase-1产生p10/p20片段，促进IL-1β和IL-18的成熟，诱导炎症反应[24]。NLRPs炎症小体激活所介导的炎症应答在NAFLD疾病进展中的作用越来越受到关注[25]。

目前，在人体中一共发现了22种炎症体[26]，常见的包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP10和NLRP12等[27]。不同类型的NLRPs的激活组装形式不尽相同，所起到作用也不尽相同。

2.1.1 NLRP1

NLRP1是首先被发现的炎症小体，可直接与caspase-1结合，并不依赖于ASC，但在ASC存在情况下，会增强NLRP1炎症体的活性[28]。与其他炎症小体不同，NLRP1炎症小体可以定位在细胞核[29]。人类具有单个NLRP1基因，而小鼠具有Nlrp1a，Nlrp1b和Nlrp1c基因[30]。人NLRP1与其鼠直向同源物之间的重要差异在于后者在N末端缺乏PYD基序。Nlrp1b炎性小体是抗炭疽杆菌的重要防御机制，因为Nlrp1b炎性小体激活的缺陷，阻碍感染了活炭疽芽孢杆菌孢子的小鼠的宿主防御。Nlrp1b在小鼠品系之间是高度多态性的。来自129S1小鼠的巨噬细胞产生功能性Nlrp1b，但缺乏其他两种同种型的mRNA表达。相反，C57BL/6小鼠表达Nlrp1a和Nlrp1c，但在Nlrp1b中具有突变，这使得Nlrp1b蛋白无功能。Nlrp1c的作用仍有待发现，但遗传数据支持Nlrp1a和Nlrp1b的炎性体信号传导作用。

2.1.2 NLRP2

NLRP2炎症小体是由Minkiewicz等[31]在2012年发现的，可以被ATP所激活，并促进炎性caspase-1及IL-1β的加工。其在不同组织中和不同疾病中的作用尚不清楚，需进一步研究。

2.1.3 NLRP3

NLRP3炎症小体是目前研究最深入最广泛的炎症体，其结构包括NLRP3、ASC和caspase-1。NLRP3炎症小体能被多种分子、细菌和病毒所激活[32]，产生活化的caspase-1片段，促进成熟的IL-1β和IL-18的释放，诱发细胞焦亡(pyroptosis)[33]。我们课题组研究发现，三氧化二砷或亚砷酸钠暴露，可以激活肝细胞、肝星状细胞和胰岛β细胞中的NLRP3炎症小体激活，引发细胞炎症反应。另外我们已经证实，NLRP3炎症小体介导的炎症反应，在三氧化二砷所导致的NASH中起到至关重要的作用[34]。也有人提出，NLRP3去泛素化是炎性体组装和活化所必需的。提出K63特异性去泛素化蛋白酶BRCC3在该步骤中从NLRP3富含亮氨酸的重复(LRR)基序去除泛素链。这是否会引发NLRP3重定位，诱导构象变化，或用于促进NLRP3炎性体组装的其他目的尚不清楚。另外，在基础状态下修饰NLRP3的E3泛素连接酶的具体作用机制尚不清楚[30]。目前，NLRP3炎症小体已经成为代谢综合征等疾病的治疗靶向[35]，寻找其上游共同受体，阐明NLRP3活化的具体机制，已经成为研究NLRP3炎症体的重要课题。

2.1.4 NLRP6

NLRP6炎症小体在肠道组织中表达较高[28]，参与调节肠道以及内环境菌群稳态。因此，一般认为NLRP6是NLRPs炎症小体家族中特异性调控肠道炎症的一类炎症体[36]。也有研究发现，NLRP6信号在不同的细胞类型可能扮演不同的角色，包括NLRP6调控炎症小体依赖及非依赖功能通路[37]。

2.1.5 NLRP10

NLRP10是NLRPs家族中唯一不含LRR结构域的成员[27]，NLRP10并不通过形成炎症小体调控caspase-1而发挥作用。因此，认为其可以负性调控其他炎症小体[38]。此外，Lautz等[39]发现NLRP10与NOD1信号通路下游的RIP2，TAK1以及NEMO作用，作为NOD10炎症体活化的适配蛋白，通过影响p38和NF-κB的活化促进由Shigella flexneri诱导的免疫应答。

2.1.6 NLRP12

NLRP12可以与ASC相关联，形成活化IL-1β成熟炎症小体[40]。实验结果证实，NLRP12缺失的小鼠NF-κB和ERK1/2活化明显增强，导致前炎症因子的过度表达，另外，可以通过促进Traf3降解，活化NIK和非经典的NF-κB通路，同时增强癌症相关基因如CXCL12和CXCL13的表达，促进结肠炎症以及肿瘤的发生[41-42]。因此，认为NLRP12是炎症反应的负向调节因子。

2.2 NLRPs炎症小体与细胞焦亡

一般情况下，炎症小体激活后会引发一种有别于自噬性损伤或细胞凋亡的另一种炎症性程序细胞死亡，即细胞焦亡。细胞焦亡发生时，一方面细胞膜上会产生分散的大小不一的离子渗透孔，引发水分流入及细胞肿胀。同时细胞内炎症小体激活使得caspase-1被剪切活化成p20/p10片段，进而促进IL-1β/IL-18的剪切成熟，并向胞外释放[43]；另一方面，caspase-1 p20/p10切割消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，使其N、C两端的结构域分开，释放N端片段。GSDMD蛋白N端片段可以识别并结合细胞膜上的磷脂类分子，并进一步在细胞膜上形成孔洞，导致细胞渗透压变化，最终使得细胞膜裂解，导致细胞焦亡的发生(图1)[44]。

2.3 细胞焦亡与炎症反应

研究表明，NLRP3等炎症小体激活与组织炎症应答密切相关，抑制NLRP3炎症小体可以有效缓解组织炎症反应[26, 43, 45-48]。事实上，炎症小体激活所导致的细胞焦亡过程中，成熟的IL-1β的释放所引发的“瀑布样炎症反应”，是其引发组织炎症应答的更重要的原因。由上一部分内容我们可以明确，细胞焦亡的发生依赖于caspase-1的活化，而活化的caspase-1的一个重要功能就是介导IL-1β前体裂解成具有活性的IL-1β。IL-1β是一种强有力的内生致热源，会刺激机体发热，白细胞趋化迁移，并表达产生更多种类的细胞因子，这些变化都体现了炎症的发生。另外，IL-1β和IL-18在一系列炎症性和自身免疫性疾病的发生机理中都起到十分重要的作用。IL-18主要促进γ干扰素(interferon-γ，IFNγ)的产生，以及T细胞、巨噬细胞的活化；IL-1β能募集、激活其他免疫细胞、IL-6等炎症性因子、粘附分子等的合成，最终形成级联反应，增强炎症应答，引发更为强烈的炎症反应[49]。同时，还有研究表明IL-1β、IL-6和IL-18具有明显的致炎作用。IL-1β作为炎症放大的启动因子，是炎症反应的主要参与者。IL-6可通过调控粘附因子的合成及诱导单核细胞趋化蛋白促进其他细胞因子的释放如IL-1、TNF-α的分泌，这些因子又可以反过来增加IL-6的表达，形成炎症因子的“瀑布样反应”[50]。

图1 细胞焦亡与其他几种细胞死亡的区别[44]Fig 1 Difference between pyroptosis and others cell death[44]

3 NLRPs炎症小体与NAFLD疾病进展

近年来研究发现，炎症反应作为上游胰岛素抵抗/脂肪变性和下游细胞损伤的中心环节，在NAFLD疾病进展中起到至关重要的作用[23]，特别是NLRPs作为重要的参与者，在NAFLD的疾病进展当中起到至关重要的作用[51]。

3.1 NLRPs炎症小体与NAFLD/NASH

单纯的良性脂肪变性或轻度NAFLD进展为NASH的关键节点，就是慢性炎症应答的产生。研究者在饮食诱导的NASH小鼠模型中观察到了IL-1β基因和蛋白表达水平的升高[52]，NLRP3敲除后，可以改善NAFLD的肝功能[53]。另外，在人NAFLD及2型糖尿病病人体内发现了NLRP3炎症小体mRNA水平的增加[54]。在NASH疾病进展中，DNA、饱和脂肪酸及LPS等均可激活炎症小体。饱和脂肪酸可以诱导NLRP3-ASC炎症小体的激活，活化caspase-1，使IL-1β和IL-18成熟，自噬体和线粒体活性氧也参与其中[55-56]。有研究发现，NLRP3炎症小体的激活参与NASH的肝细胞焦亡、炎症以及纤维化发生当中[43, 57]，而NLRP3，ASC或caspase-1缺失的小鼠表现出体重增加量及脂肪含量的减少[58]。我们课题组目前研究也证实，在三氧化二砷导致小鼠NAFLD当中，自噬水平上调，自噬溶酶体降解将组织蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)释放到胞浆当中，激活NLRP3炎症小体，引发细胞焦亡及炎症反应[34]。当然，也有完全相反的研究结果表明，ASC敲除小鼠更容易发生脂肪变性，肥胖甚至葡萄糖耐量受损[59]，研究者认为，这种差异是由于肠道微生态的改变所造成的。

3.2 NLRPs炎症小体相关菌群改变与NAFLD/NASH

近年来有学者提出，肠道菌群的改变可以影响NAFLD的疾病进展[60]。肠道微生物群破坏(生态失调)诱导的炎症可能有助于改变肠道的屏障功能和细菌移位。最近的证据表明，炎症小体是这一过程的核心，通过调节肠道微生物群从而调节由微生物群驱动的NAFLD表型。炎症小体是外源性PAMPs和DAMPs的传感器，其调节caspase-1介导对炎性细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18的前体的切割。NLRP3和NLRP6炎症小体敲除后，小鼠体内普雷沃菌科(Prevotellaceae)和细菌科TM7等主要成分显著增加，进而促进NAFLD疾病进展。

Henao-Mejia等[59]研究发现，NLRP3炎症小体可以与肠道菌群发生交互作用。研究者发现，4周龄的NAFLD和NASH模型小鼠敲除NLRP3炎症小体复合物及IL-18后，肝脏炎症及脂肪变性水平显著增加。并且将基因敲除鼠与野生型小鼠共同饲养后，野生型小鼠出现了相同的表型，表明炎症小体缺失的小鼠存在可传染性肠道菌群的表型，造成饮食诱导性肝脏疾病的风险增强。另外，NLRP6炎症小体缺失小鼠，肠道菌群与宿主之间的交互作用发生改变，发生脂肪变性向NASH的过渡[60]。另有研究表明，NLRP6或ASC缺陷型大鼠，经硫酸葡聚糖(DSS)诱导后，结肠上皮细胞IL-18水平降低，出现自发性结肠增生，招募炎性细胞聚集。与野生型DSS诱导的大鼠相比，缺陷型大鼠有更为严重的结肠炎性反应[61]。炎症性肠病会大大提高NASH的发生率，而通过抗TNF-α治疗可减少NASH的发生率[62]。抗生素治疗均可降低炎性小体缺陷小鼠NASH的严重程度，并消除对野生型小鼠的传染性表型效应。因此，生态失调可诱发结肠炎症和细菌移位，影响从肝脏脂肪变性到NASH的进展。肝脏炎症小体可能在维持宿主肠道微生态与NASH相关炎症调控之前的稳态当中起关键性作用。

3.3 NLRPs炎症小体与胰岛素抵抗

研究表明，IL-1β阻断可以作为代谢疾病的治疗方案[26]。实际上，有临床研究报道了IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)或IL-1β抗体在治疗T2D中的保护作用。在一项涉及70名T2D患者的双盲平行组试验中，IL-1受体拮抗剂Anakinra改善了血糖和β细胞分泌功能，并减少了全身炎症标志物。另一项研究报道，单次注射抗IL-1β抗体可以改善胰岛素分泌。总之，临床和实验结果均表明IL-1β损害胰岛素信号传导并诱导胰岛素抗性的发展和/或维持。而格列本脲，一种广泛使用的T2D药物，抑制NLRP3炎性体介导的caspase-1活化和IL-1β/IL-18分泌，提高了IL-1β抑制，可能有助于格列本脲的抗糖尿病作用。

尽管科学家们对IL-1β在代谢疾病中的作用进行了广泛的研究，但在代谢应激条件下产生和释放IL-1β的机制仍然未知。最近的两项研究报道，高水平的葡萄糖[63]和胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)[64]是IL-1β产生和NLRP3炎性体激活的关键诱导物。前者表明高水平的葡萄糖诱导ROS产生，其随后通过介导NLRP3和TXNIP在β细胞中的直接结合来激活NLRP3炎性体。后者报道葡萄糖和TXNIP均不介导NLRP3炎性小体的激活和IL-1β加工。相反，他们发现IAPP诱导NLRP3炎性体激活和IL-1β成熟。IAPP是一种与胰岛素一起分泌的激素，沉积在T2D患者的胰岛间质中。众所周知，IAPP对β细胞具有细胞毒作用，并诱导细胞功能障碍和细胞凋亡。这些研究成果，提供了NLRP3炎性体和T2D之间联系新的机制见解。

3.4 NLRPs炎症小体与肝纤维化

研究表明，在纤维化或局部缺血的创伤性损伤期间，一系列的NLRP3激动剂被释放出来[26]。Riteau等[65]利用博莱霉素诱导的小鼠肺损伤来模拟人类的肺纤维化，证实了该途径在气道炎症和组织重塑中的作用。此外，患有特发性肺纤维化的患者的支气管肺泡灌洗液含有高水平的ATP，为人类疾病提供体内相关性。

近年来已有研究表明，NLRP3炎症小体激活与肝脏纤维化进程关系密切[47, 66-67]。Auvro R等[47]在MCD喂养的小鼠中的结果证明，应用NLRP3炎症小体小分子抑制剂MCC950，可以有效抵抗肝纤维化发展以及胶原沉积的减少。在更长期的肥胖/糖尿病模型中，16周至24周的数据进一步证明了这一发现，并表明一旦NASH发生，NLRP3抑制剂治疗可能阻止或消除肝纤维化，但是MCC950阻断NLRP3逆转NASH中晚期肝纤维化的程度，需要在进一步的研究中证实。Maria等[67]的结果表明，HSC中NLRP3的持续激活导致肝脏中α-SMA和结蛋白阳性细胞的比率显著上调，促进胶原分泌的自发增加和肝纤维化的发展。而这些纤维化变化发生在没有炎性浸润的情况下，突显了NLRP3炎性小体在HSC活化和肝纤维化反应中的直接作用。Wree A等[66]研究结果表明，NLRP3持续激活4周后，将会导致趋化因子(如ICAM1和CXCL2)显著上调，肝脏炎症表现为炎症分级增加，浸润性骨髓细胞数量以及pro-caspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平升高。在饮食诱导的小鼠肝脏中，NLRP3炎症小体的激活进一步增加HSC活化，具有显著的促纤维化反应。这些结果表明，持续的NLRP3激活作为一种重要的“打击”，有助于脂肪变性在NAFLD发展过程中作为“第一次打击”，导致更严重的肝脏损伤展。

4 小 结

近年来，炎症在NAFLD疾病进展中的作用越来越受到重视，对其机制的研究也越来越多。依赖于NLRPs炎症小体激活的细胞焦亡也是这些年的研究热点，其引起的炎症应答也被认为是疾病进展的推动者。各类NLRPs影响NAFLD疾病进展的不同的分子机制还需我们进一步的探究。